*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶促反响动力学研究方法介绍,EXPERIMENT 3,碱性磷酸酶km值测定,实验目的,学习环境因素对酶促反响速度的影响；,学习米氏方程及Km值得测定；,测量碱性磷酸酶km值；,实验原理,E的反响速度受到环境因素的影响，这些因素包,括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等,一米曼氏方程式,中间产物,酶促反响模式中间产物学说,E+S,k,1,k,2,k,3,ES,E+P,相关E学原理,1913年Michaelis和Menten提出反响速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度,V：不同S时的反响速度,Vmax：最大反响速度(maximum velocity),m：米氏常数(Michaelis constant),V,max,S,K,m,+S,米曼氏方程式推导基于两个假设：,(1)E与S形成ES复合物的反响是快速平衡反响，而ES分解为E及P的反响为慢反响，反响速度取决于慢反响即 Vk3ES。,(2)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反响的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。,推导过程,稳态：,是指ES的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定。,K,1,(E,t,ES)SK,2,ES+K,3,ES,K,2,+K,3,K,m,（米氏常数）,K,1,令：,那么(2)变为:(EtES)S Km ES,(2),(E,t,ES)S,K,2,+K,3,ES,K,1,整理得：,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EtES，反响达最大速度,VmaxK3ESK3Et (5),ES,E,t,S,K,m,+S,(3),整理得:,将(5)代入(4)得米氏方程式：,V,max,S,K,m,+S,V,将(3)代入(1)得,K,3,E,t,S,K,m,+S,(4),V,当反响速度为最大反响速度一半时,K,m,值的推导,K,m,S,Km值等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,2,K,m,+S,V,max,V,max,S,V,max,V,S,K,m,V,max,/2,二Km与Vmax的意义,Km值,Km等于酶促反响速度为最大反响速度一半时的底物浓度。,意义：,a)Km是酶的特征性常数之一；,b)Km可近似表示酶对底物的亲和力；,c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Vmax,定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反响速度，与酶浓度成正比。,意义：Vmax=K3 E,如果酶的总浓度，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。,定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。,意义 可用来比较每单位酶的催化能力。,酶的转换数,三m值与max值的测定,双倒数作图法(double reciprocal plot),-1/K,m,1/V,max,1/S,1/V,V,max,S,K,m,+S,V=,林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程,+,1/V=,K,m,V,max,1/V,max,1/S,两边同取倒数,Hanes作图法,S,S/V,-K,m,K,m,/V,m,在林贝氏方程根底上，两边同乘S,S/V=K,m,/V,max,+S/V,max,酶浓度对反响速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反响速度与酶浓度成正比。,关系式为：V=K3 E,0,V,E,当S,E,时，V,max,=k,3,E,酶浓度对反应速度的影响,双重影响,温度升高，酶促反响速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反响速度降低。,温度对反响速度的影响,最适温度(optimum temperature)：,酶促反响速度最快时的环境温度。,*低温的应用,酶,活,性,0.5,1.0,2.0,1.5,0 10 20 30 40 50 60,温度 C,温度对淀粉酶活性的影响,pH对反响速度的影响,最适,pH (optimum pH),：,酶催化活性最大时的环境,pH,。,0,酶,活,性,pH,pH对某些酶活性的影响,胃蛋白酶,淀粉酶,胆碱酯酶,2,4,6,8,10,碱性磷酸酶km值的测定,以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件下(pH=10.0，37)，准确反响15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反响式如下：,然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反响速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。,1酚试剂,22.5mmolL磷酸苯二钠基质液,3碱性缓冲液(pH-10.0),4碱性磷酸酶液,【,试剂,】,称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。,称取无水Na,2,CO,3,6.36g和NaHcO,3,3.36g，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。,称取碱性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。,操作,试剂,（ml）,1,2,3,4,5,6,2.5mM,磷酸苯二钠,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.0,蒸馏水,0.8,0.6,0.4,0.2,碱性缓冲液,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,混匀后，37水浴5min,碱性磷酸酶,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,混匀后，37水浴15min(准确计时）,酚试剂,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,碱性磷酸酶,0.1,10%碳酸钠,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。,实验数据及结果,管号,A,650,1/,A,650,s,1/s,1,2,3,4,5,6,以上述数据双倒数作图，求出,碱性磷酸酶的K,m,值。,Km值的定义和意义是什么？,米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？,【实验讨论】,参加碱性磷酸酶液的量要准确，否那么误差较大。,保湿时间要准确。,【本卷须知】,