,知识点一,PCR,扩增的原理和过程,知识点二,PCR,扩增的实验操作,自主预习，自我领悟,难重聚焦，质疑解惑,知识点一,PCR,扩增的原理和过程,自主预习，自我领悟,难重聚焦，质疑解惑,知识点二,PCR,扩增的实验操作,自主预习，自我领悟,难重聚焦，质疑解惑,*,*,*,*,*,*,实验,13DNA,片段的,PCR,扩增,实验13DNA片段的PCR扩增,1,细胞内,DNA,复制的条件,原料,4,种,模板,2,条,DNA,母链,酶,和,引物,使,DNA,聚合酶能够从引物的,开始连接脱氧核苷酸,脱氧核苷酸,解旋酶,DNA,聚合酶,3,端,1细胞内DNA复制的条件原料,2,PCR,扩增的原理及条件,(1)PCR,技术：即,，是一种,迅速扩增,的技术。它能以极少量的,为模板，在短时间内复制出上百万份的,DNA,拷贝。,(2),扩增方向：总是从子链的,端向,端延伸。,多聚酶链式反应,体外,DNA,片段,DNA,5,3,2PCR扩增的原理及条件多聚酶链式反应体外,(3),引物：,特点：是一小段,或,，能与,的一段碱基序列互补配对，用于,PCR,的引物长度通常为,个核苷酸。,需要引物的原因：,DNA,聚合酶不能,，而只能从,延伸,DNA,链，因此,DNA,复制需要引物。,DNA,RNA,DNA,母链,20,30,从头合成,DNA,3,端,(3)引物：DNARNADNA母链2030,3,PCR,的反应过程,(1),：温度上升到,90,以上时，双链,DNA,解旋为,单链,(2),：温度下降到,50,左右，两种引物通过碱基互补,配对与两条单链,DNA,结合,(3),：温度上升到,72,左右时，在,酶的作,用下，四种脱氧核苷酸通过碱基互补配对合,成新,DNA,链,变性,复性,延伸,DNA,聚合,3PCR的反应过程变性复性延伸DNA聚合,1,DNA,复制时为什么需要引物？,提示：,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，而只能从,3,端延伸,DNA,链。,2,PCR,扩增,DNA,过程中是否还需要解旋酶？,提示：,不需要。,3,利用,PCR,技术扩增,1,个,DNA,分子,n,次，所得,DNA,分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的,DNA,分子所占的比例是多少？,提示：,1/2,n,；,100%,。,思考探究,1DNA复制时为什么需要引物？思考探究,1,细胞内,DNA,复制与体外,DNA,扩增,(PCR,技术,),的比较,细胞内,DNA,复制,PCR,不,同,点,解旋,解旋酶，边解旋边复制,80,100,高温解旋，双链完全分开,酶,DNA,解旋酶、,DNA,聚合酶、,DNA,连接酶,TaqDNA,聚合酶,引物,RNA,DNA,或,RNA,温度,体内温和条件,高温,子链,合成,一条链连续,(,先导链,),，另一条链不连续，先合成片段，再由,DNA,连接酶连结,(,滞后链,),两条子链均连续合成,相同点,提供,DNA,模板,四种脱氧核苷酸作原料,子链延伸的方向都是从,5,端到,3,端,1细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较细胞,2,PCR,反应过程,(1),变性：当温度上升到,90,以上,时，双链,DNA,解聚为单链，如图：,2PCR反应过程,(2),复性：系统温度下降至,50,左右,时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链,DNA,结合，如下图：,(2)复性：系统温度下降至50左右时，两种引物通过碱基互补,(3),延伸：当系统温度上升至,72,左右，溶液中的四种脱氧核苷酸,(A,、,T,、,G,、,C),在,DNA,聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的,DNA,链，如下图：,(3)延伸：当系统温度上升至72左右，溶液中的四种脱氧核苷,PCR,反应的结果：,PCR,一般要经历三十多次循环，每次循环都包括,变性、复性、延伸,三步。,两引物之间的固定长度的,DNA,序列呈,指数扩增,。,特别提醒,PCR反应的结果：特别提醒,例,1,多聚酶链式反应,(PCR),是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术。,PCR,过程一般经历下述三十多次循环：,95,下变性,(,使模板,DNA,解旋,)55,下复性,(,引物与,DNA,模板链结合,)72,下延伸,(,形成新的脱氧核苷酸链,),。下列有关,PCR,过程的叙述中不正确的是,(,),例1 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片,A,变性过程中破坏的是,DNA,分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现,B,复性过程中引物与,DNA,模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的,C,延伸过程中需要,DNA,聚合酶和四种核糖核苷酸,D,PCR,与细胞内,DNA,复制相比所需要酶的最适温度较高,A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用,解析,变性是为了使,DNA,内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与,DNA,模板链结合；延伸时是形成新的,DNA,分子，需要以脱氧核苷酸为原料；,PCR,过程的温度高，会导致一般的,DNA,聚合酶失活，需特定的耐高温,DNA,聚合酶。,答案,C,解析变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内,例,2,在遗传病及刑侦破案中常需要对样品,DNA,进行分析，,PCR,技术能快速扩增,DNA,片段，在几个小时内复制出上百万份的,DNA,拷贝，有效地解决了因为样品中,DNA,含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：,例2 在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，P,a,链,5,G,GT,C,3,5,G,G,OH(,引物,),b,链,3,C,CA,G,5 (,引物,),95,5,G,GT,C,3,3,C,CA,G,5,55,5,G,GT,C,3,3,C,CA,G,5,72 5,G,G,OH,_,_,a链 5GGTC35GGOH(引物,(1),在相应的横线上写出引物,，并在复性这一步骤中将引物,置于合适的位置。,(2),在相应的横线上写出循环一次后生成的,DNA,分子。,(3),若将作为原料的四种脱氧核苷酸用,32,P,标记，请分析循环一次后生成的,DNA,分子的特点是,_,；循环,n,次后生成的,DNA,分子中不含放射性的单链占总单链的比例为,_,。,(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置,解析,(1)DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,3,端延伸,DNA,链，引物就提供了,3,端。子链延伸方向为,53,，引物,与,b,链部分碱基互补，引物,则与,a,链部分碱基互补，且连接到,a,链的,3,端，故引物,的结构为,5,G,A,OH,，复性结果为：,HO,A,G,5,5,G,GT,C,3,。,解析(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3,(2),经过一次循环后，产生的两个,DNA,分子分别含有引物,和引物,。,(3),由于作为原料的四种脱氧核苷酸被,32,P,标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个,DNA,各有一条链含,32,P,，若复制,n,次，产生子链共,2,n,2,，其中只有亲本的两条母链不含,32,P,，则其所占比例为,2/(2,n,2),1/2,n,。,(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物和引,答案,(1)5,G,A,OH,a,链,5,G,GT,C,3,HO,A,G,5,(2)5,G,GT,C,3,3,C,CA,G,5,3,C,CA,G,5,5,G,GT,C,3,(3),每个,DNA,分子各有一条链含,32,P,标记,1/2,n,答案(1)5GAOH,浙科版生物选修一生物技术实践-DNA片段的PCR扩增复习ppt课件-新版,微量移液器,1,实验操作程序,准备：按照,PCR,反应体系的配方将所需试剂摆放,于实验桌上,移液：用,按照配方在微量离心管中依,次加入各组分,混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,微量移液器1实验操作程序,：将微量离心管放在离心机上，离心约,10 s,。目的是使反应液集中在,反应：将离心管放入,中，设置程序进行反应。,离心管底部,PCR,仪,离心,：将微量离心管放在离心机上，离心约10,2,DNA,含量的测定,(1),原理：利用,DNA,在,的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。,(2),计算公式：,DNA,含量,(g/mL),50(260 nm,的读数,),稀释倍数。,260nm,2DNA含量的测定260nm,1,实验操作注意事项,(1),为避免外源,DNA,等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。,(2),所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在,20,储存。,(3),在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。,1实验操作注意事项,2,结果分析与评价,DNA,在,260nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用,DNA,的这一特点进行,DNA,含量的测量，以判断,DNA,片段的扩增是否成功。具体方法如下：,(1),稀释：取,2LPCR,反应液，加入,98L,蒸馏水，即将样品进行,50,倍稀释。,(2),对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计的读数调节至零。,2结果分析与评价,(4),计算：检测,DNA,片段的扩增情况，可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果，计算公式为：,DNA,含量,(g/mL),50(260 nm,的读数,),稀释倍数。,(3),测定：取,DNA,稀释液,100L,至比色杯，需测定,260nm,处的光吸收值。,(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量,如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：,漏加了,PCR,的反应成分，各反应成分的用量不当，,PCR,程序设置不当等,。,公式中的,50,代表在波长,260nm,紫外波段照射下，吸收峰为,1,时，,DNA,含量为,50g/mL,。,特别提醒,如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加,理论上,DNA,扩增呈指数增长。若只有一个,DNA,分子作模板，则复制,n,次后有,2,n,个,DNA,分子；若一开始有,m,个,DNA,分子作模板，则复制,n,次后有,m2,n,个,DNA,分子；实际操作过程中由于无关变量的影响，一般来说实际值要略小于理论值。,归纳拓展,DNA,扩增数目的理论计算,退出,理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一个DNA分子作模,