,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 酶制剂生产,第八章 酶制剂生产,1,前言,20世纪20年代，,法国人,Biondin与Effront 在,德国,建厂生产,枯草杆菌淀粉酶,来代替麦芽淀粉酶，用于棉布褪浆，为微生物酶的工业生产奠定了基础。40年代，抗生素工业兴起，,深层培养技术,不久就被用于淀粉酶的制造，使酶制剂工业跨进了工业化生产的时代。50 年代末，,糖化酶,成功用于葡萄糖生产，革除了沿用上百年的酸水解工艺。60年代中期，,加酶洗涤剂,大流行，进一步促进了酶制剂工业的发展。70年代初,固定化葡萄糖异构酶,用于生产果脯糖浆，大大推动了食品工业与酶制剂工业的发展。随着酶制剂的普遍应用与固定化酶的广泛研究，促进了生物催化技术与化学工程密切结合，诞生了一门新学科,酶工程,1971年在美国召开第一次国际酶工程会议，把大规模生产、分离提纯、固定化技术、酶反应器设计，以及酶的工业应用都纳入了酶工程的范围，并成为当时（,20世纪70年代至80年代中期,）初生物技术五大技术体系中最活跃、发展最快、成效最大的一个体系。,前言20世纪20年代，法国人Biondin与Effront,2,第一节酶制剂的工业化生产,一、工业化酶制剂生产的优点,自1894 年,米曲霉高峰淀粉酶,问世，1923年枯草杆菌,-,淀粉酶工业化应用以来，微生物酶制剂工业逐渐发展成为一个新兴的产业部门，发展势 头方兴未艾。目前的,800,多种商品酶中，大多数是利用微生物生产的。,利用微生物发酵法大规模生产酶制剂，具有以下几个明显的优点。,第一节酶制剂的工业化生产一、工业化酶制剂生产的优点,3,优点,（一）酶的品种多，新酶种易得,微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得到；倒是有许多酶目前还只在微生物中发现，而未能从动植物中找到。,（二）菌种易诱变，代谢易调控,微生物代谢方式各种各样，又极易受外界因素的影响，很容易通过诱变等简便的育种方法改变原来的代谢途径，得到预想的代谢途径，实现代谢的人为调控。,优点（一）酶的品种多，新酶种易得,4,（三）生产周期短，酶的产量大,微生物细胞构造简单，没有分化的营养器官，而是以细胞表面直接与环境接触，所以代谢速度比高等生物快得多，其繁殖速度快，生产效率高，生产周期短，培养简便，并可通过控制培养条件提高酶的产量。相比动植物组织酶提取，不受动植物原料量和来源的约束，周期短，产酶量大,（四）基因易操纵，优质种易得,基因工程技术中，以微生物为对象的研究水平远远领先于动植物，进行微生物的基因改造要比动植物方便得多，技术水平也成熟得多。生物技术在酶工程中的应用（如多拷贝酶基因的菌种）远远领先于其他工程体系，早已产业化，并产生了巨大的经济效益和社会效益。,（三）生产周期短，酶的产量大,5,二、酶制剂生产的基本工艺流程,（一）基本工艺流程图,微生物发酵法生产酶制剂，分,固态发酵法,、,液态发酵法,和,载体发酵法,三大类。由于载体发酵法还没有用于大规模生产，以介绍固态发酵和液态发酵为主。,虽然因为具体的生产菌不同、目的酶不同、生产设备不同、生产条件不同，采用的工艺有所不同，但酶制剂生产基本工艺流程大致如图8-1,二、酶制剂生产的基本工艺流程（一）基本工艺流程图,6,工艺要点,固态发酵法,（1),原料处理碳源,淀粉质;氮源,麸皮,(2)菌种培育与接种：液体、固体等,(3)无菌要求相对较低,(4)发酵工艺控制好温度和湿度，不需要调节PH,(5)提取纯化成熟曲烘干、粉碎、过筛，得到粗酶粉。精制则加水抽提，分离去除固形物，浓缩，盐析或有机溶剂沉淀，离子交换层析进一步纯化。,2.液体发酵法,（1)原料处理：葡萄糖等单糖为碳源,(2)菌种培育与接种：液体培养，几级罐,(3)无菌要求要求较高,(4)发酵工艺控制PH、温度、通风量,(5)提取纯化真空浓缩得酶液。精制则加水抽提，分离去除固形物，浓缩，盐析或有机溶剂沉淀，离子交换层析进一步纯化,工艺要点固态发酵法,7,第二节 淀粉酶,淀粉酶,是水解淀粉物质的一类酶的总称，广泛存在于动植物和微生物中。它是最早实现工业化生产并且至今为止应用最广、产量最大的一类酶制剂。,按照水解淀粉方式不同，可将淀粉酶分为四大类：,淀粉酶,、,淀粉酶,、葡萄糖淀粉酶,和解枝酶,（异淀粉酶）。,此外，还有一些与工业有关的淀粉酶如,环化糊精生成酶,（这种酶可使6、7个葡萄糖构成环化糊精）、,G4、G6生成酶,（可从淀粉非还原端切割下4-6个葡萄糖分子构成寡糖），还有,-,葡萄糖苷酶,，又称葡萄糖苷转移酶（可将游离葡萄糖转移到其他葡萄糖基的,-1,6,位上，生成含,-1,6,糖苷键的寡糖）。,第二节 淀粉酶 淀粉酶是水解淀粉物质的一类酶的总称，广泛存,8,一、,-淀粉酶,工业上大规模生产和应用的,-淀粉酶主要来自细菌和曲霉，特别是,枯草杆菌,，我国淀粉糖化工业使用的液化酶BF-7658、美国的enase 等属于这一种。,由,微生物制备酶制剂,，产酶量高，易于分离和精制，适于大量生产。当然亦能从植物和动物 中提取,-淀粉酶，满足特殊的需要，但由于成本高，产量低，目前还不能实现工 业化生产。具有实用价值的-淀粉酶生产菌列于表8-1,一、-淀粉酶工业上大规模生产和应用的-淀粉酶主要来自细,9,由于菌种不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生,-,淀粉酶的能力已是原始菌株的数倍乃至数十倍,霉菌,-,淀粉酶,大多采用固体曲法生产:,麸皮,为主要原料，米糠或豆饼的,碱水浸出,液，以补充氮源;32-35,培养36-48h,40 烘干或风干,粗酶,细菌淀粉酶,则以液体深层发酵为主:以麸皮、玉米粉、豆饼粉、米糠、玉米浆等为,原料,，补充无机,氮源,此外还需添加少量镁盐、磷酸盐、钙盐等。37,通风搅拌培养24-28h,离心或以硅藻土作助滤剂除去菌体及不溶物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂、稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。这种液体的细菌,-淀粉酶呈暗褐色，带不愉快的臭味，,在室温下放置数月而不失活。,由于菌种不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生-淀粉酶,10,为制备高活性的,-,淀粉酶，并使贮运方便，可把发酵滤液用硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀制成,粉状酶制剂,，最好贮存在25以下，较干燥、避光的地方,为制备高活性的-淀粉酶，并使贮运方便，可把发酵滤液用硫酸铵,11,枯草杆菌BF-7658,是我国产量最大、用途最广的一种液化型,-,淀粉酶，其最适pH6.5左右，最适温度65,多次物理、化学诱变后获得一株,11-12菌株,，酶活力比原菌株提高50%，在马铃薯培养基中生长良好,枯草杆菌BF-7658是我国产量最大、用途最广的一种液化型,12,孢子斜面培养,：马铃薯培养基50mL，37,72h,种子培养,：标准夹套罐（500L，直径70cm,高160cm)，371，罐压0.5-0.8大气压，通风量0-10h，13.5m3/h;10-14h,17.5m3/h.培养12-14h,大罐,：3000L标准罐，低浓度发酵，高浓度补料，基础料：补料体检：3:1,孢子斜面培养：马铃薯培养基50mL，37,72h,13,工业上回收,-,淀粉酶常用,盐析,、,有机溶剂沉淀,和,淀粉吸附,三种方法。其中盐析法在工业中用得比较普遍,用于盐析,-,淀粉酶的中性盐有,硫酸铵,、,硫酸钠,等。其中以硫酸铵最为常用，因为此盐的溶解度较大。,工业上回收-淀粉酶常用盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附三种方,14,二、,-淀粉酶,-,淀粉酶过去主要是从麦芽、大麦、甘薯、大豆等高等植物中提取。近几年来，发现不少微生物能产,-,淀粉酶，微生物的,-,淀粉酶从其对淀粉的作用上来看，与高等植物的,-,淀粉酶是一致的，而在,耐热性,等方面都比高等植物更适合于工业化应用。,目前，对产,-,淀粉酶菌种研究较多的是,多黏芽孢杆菌,、,巨大芽孢杆菌,、,蜡状芽孢杆菌,、环状芽孢杆菌和链霉菌等。它们有可能发展成为微生物,-,淀粉酶的生产菌种。,由于异淀粉酶和,-,淀粉酶可以相互配合使用，可以筛选同时具有这两种酶的菌种。据报道，日本从土壤中分离到,蜡状芽孢杆菌,蕈状变种，在所培养的条件下，可以同时产生,-,淀粉酶和异淀粉酶。,二、-淀粉酶-淀粉酶过去主要是从麦芽、大麦、甘薯、大豆等,15,-淀粉酶生产过程,菌种,：巨大芽孢杆菌，耐热性,发酵培养基,：淀粉3%，葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0.5%,34,搅拌培养,48h，酶活：25.5U/mL,发酵液8000r/min 离心20min,除菌体，加硫酸铵沉淀得,粗酶,，,0.01moL/L醋酸盐溶解，自来水透析3d,加25%醋酸铅溶液，离心除去沉淀杂质，,硫酸铵盐析,较纯,-淀粉酶，,酶活：100U/mL,总收率,50%,-淀粉酶生产过程菌种：巨大芽孢杆菌，耐热性,16,近十几年来，国内外的微生物工作者在菌种的诱变和发酵条件等方面都做了大量的研究工作。例如，,日本人,新家龙把,蜡状芽孢杆菌Bg10,用紫外线处理后，获得的变异株产,-,淀粉酶的能力比亲株提高约25-30倍。此菌株不需要淀粉诱导物，在不含碳源而含0.5%牛肉膏的基础培养基中，也可以生成,-,淀粉酶；钾离子可提高酶的生成量，麦芽糖反而抑制,-,淀粉酶的生成。,近十几年来，国内外的微生物工作者在菌种的诱变和发酵条件等方面,17,日本天野制药公司,采用,多黏芽孢杆菌ATCC8523,生产,-淀粉酶时，使用高浓度碳源的培养液，最初温度为36-40,，等到对数生长期后，降温至30-34,，,继续进行发酵，60h后,淀粉酶的生成量为105U/mL,高浓度碳源培养液的配方为：薯淀粉10%、硫酸铵0.75%、玉米浆0.5%、酵母膏0.2%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.75%、水0.05%,日本天野制药公司采用多黏芽孢杆菌ATCC8523生产-淀粉,18,三 糖化酶,糖化酶的生产菌种各国不一。美国主要采用,臭曲霉,，丹麦主要采用,黑曲霉,，日本主要采用,拟内孢霉,和,根,霉，前苏联则主要偏向研究拟内孢霉。我国糖化酶的生产也主要采用,黑曲霉,作为菌种,三 糖化酶糖化酶的生产菌种各国不一。美国主要采用臭曲霉，丹,19,黑曲霉液体深层通风培养法生产糖化酶,在用黑曲霉生产糖化酶的初期，产品主要应用于由淀粉制取葡萄糖。糖化酶的工业生产虽始于1965 年，但当时菌种活性较低，发酵单位不高，因而成本过高，不易开发应用。1977年中国科学研究所选育出,黑曲霉变异株UV-11,，但其深层发酵要求高速搅拌及需用玉米浆等条件，因而当时在生产中全面推广还有很大的困难。,1978年,无锡轻工业学院,进一步选育菌种和研究培养条件，以提高糖化酶发酵的活性。经多年的努力，完成中试并通过鉴定。1981年起组织推广并开发应用于酒精、白酒工业生产中。由于该成果的经济效益显著，年获国家科技进步一等奖。,黑曲霉液体深层通风培养法生产糖化酶在用黑曲霉生产糖化酶的初期,20,斜面培养,：查式培养基，31培养6-7d,种子罐：2m3不锈钢，配方：玉米浆4%，豆饼粉3%，麸皮1%，转速320r/min,31-32 培养，罐压0.5大气压，通风量0.5/min（v/v),培养30-40h,酶活：300-500U/mL,发酵罐,：20m3，配方：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%，糠油5L，PH4.0，转速180r/min，30-32 培养，罐压0.5大气压，,通风量:0-12h,0.5/min（v/v),12-14h,0.8/min,24-84h,1/min,84h后,0.8/min,斜面培养：查式培养基，31培养6-7d,21,发酵工艺控制,PH:,控制4.0，方法：磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、氢氧化铵，含氮有机物、碳水化合物等的比例来调节,溶氧,：中间补料，基础料：补料体积：3:1,2-3次补料，改善发酵通风比，需氧满足，酶活增长,发酵工艺控制PH:控制4.0，方法：磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐,22,发酵工程（大生产）操作是控制罐内培养液的体积（以调节培养基配比）以及总残糖、PH、