Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,荧光分析法,第一页，共29页。,年诺贝尔化学奖,绿色荧光蛋白（GFP）,第二页，共29页。,green fluorescence protein,科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质,GFP,标记的微管,第三页，共29页。,荧光与荧光分析法（,fluorescene and fluorometry),荧光,（,fluorescene):,物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低能级返回基态时发射出的光。,荧光分析法（,fluorometry),：,根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度高，检测限达,10,-10,g/ml,甚至,10,-12,g/ml,。,第四页，共29页。,电子能级的多重态,电子能级的多重度：,M,=2,S,+1,S,为电子自旋量子数的代数和(0或1),M,=1,，单重态，用,S,表示（,single state,）,M,3,，三重态，用,T,表示（,triplet state,）,能,量,单重基态,激发单重态,激发三重态,禁阻跃迁,第五页，共29页。,S,2,S,1,S,0,T,1,吸,收,发,射,荧,光,发,射,磷,光,能,量,l,2,l,1,l,3,外转换,l,2,体系间跨越,振动弛豫,内转换,第六页，共29页。,激发态基态的能量传递途径,传递途径,辐射跃迁,荧光,内转换,外转换,体系间跨越,振动弛豫,无辐射跃迁,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，,发光强度相对大。,荧光：10,-7,10,-9,s,第一激发单重态的最低振动能级基态,磷光：10,-4,10,s,，第一激发三重态的最低振动能级基态,磷光,第七页，共29页。,激发光谱与荧光光谱,excitation spectrum and fluorescence spectrum,1.荧光(磷光)的,激发光谱,：,固定测量波长,化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线,。,2.,荧光(磷光)的,发射光谱：,固定激发光波长,化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。,第八页，共29页。,nm,F,200,260,320,380,440,500,560,620,荧光激发光谱,荧光发射光谱,磷光光谱,室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱,第九页，共29页。,3 K I0 cl =Kc,影响荧光强度的外部因素,注意：当cl时，F与C不成正比。,M=1，单重态，用S表示（single state）,散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。,使荧光效率提高，荧光波长增长。,荧光的产生与分子结构的关系,a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。,固定测量波长,化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。,丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱,具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）,瑞利光（Reyleigh scattering light),由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-cl),有机化合物的荧光分析,有机化合物的荧光分析,GFP,的激发光谱与荧光光谱,第十页，共29页。,激发光谱与发射光谱的关系,位移,荧光发射波长大于激发波长的现象。,内转换和,振动弛豫是主要原因。,2,.,发射光谱的形状与激发波长无关,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量,产生不同吸收带，,但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。,3,.,镜像关系,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。,第十一页，共29页。,nm,蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）,第十二页，共29页。,200,250,300,350,400,450,500,nm,F,S,0,S,1,*,V=0,V=1,V=2,V=0,V=1,V=2,b,0,b,1,b,2,c,2,c,1,c,0,E,2,E,1,E,2,E,1,b,0,c,0,b,1,b,2,c,1,c,2,镜像关系解释示意,第十三页，共29页。,荧光的产生与分子结构的关系,分子产生荧光必须具备的条件,1.,具有强的可见紫外吸收,(,长共轭分子）,2.,具有一定的荧光效率（,f,）（刚性平面分子）,第十四页，共29页。,长共轭结构,苯 萘 蒽,ex,205nm 286nm 356nm,em,278nm 321nm 404nm,f,维生素,A,ex,327nm,，,em,510nm,第十五页，共29页。,刚性平面结构,可降低化学键的旋转，增加共轭健的共平面性，使荧光效率增加。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,第十六页，共29页。,取代基,第一类：增加分子的,电子共轭程度，,使荧光效率提高，荧光波长增长。如,-NH,2,、,-OH,、,-OCH,3,、,-NHR,、,-CN,。,第二类：减弱分子的,电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。如：,-COOH,、,-NO,2,、,-C,O,、,-X,、,-NO,、,-SH,。,第三类：对,电子共轭作用较小，对荧光的影响不明显。如：,-R,、,-SO,3,H,、,-NH,3,+,。,第十七页，共29页。,荧光试剂,能与弱荧光物质或无机离子反应生,成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析,法的应用范围。,荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。,邻苯二甲醛（,OPA,）：测定伯胺、,-,氨基酸。,丹酰氯,:,测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱,测定无机离子的荧光试剂,第十八页，共29页。,影响荧光强度的外部因素,1.,温度,荧光强度对温度变化敏感，温度增加，,荧光效率降低。,2.,溶剂,溶剂的极性、氢键、配位键的形成、粘度都将使化合物的荧光发生变化。极性、粘度增强，荧光波长长移，强度增加。,对酸碱化合物，溶液,pH,的影响较大，需要严格控制。不同荧光物质有其最适宜的,pH,值范围。,第十九页，共29页。,影响荧光强度的外部因素,4.,荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、,氧分子、硝基化合物、重氮化合物、,羰基和羧基化合物。,5.,散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。,瑞利光（,Reyleigh scattering light),拉曼光,(Raman scattering light),波长比入射光更长的拉曼光，对荧光测定的干扰更大。,第二十页，共29页。,a,b,a,：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光,b,：硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光,第二十一页，共29页。,溶液的荧光测定,入射光,I,0,透射光,I,荧光,F,第二十二页，共29页。,定量依据,荧光强度,F,正比于吸收的光强度,I,a,和荧光量子效率,：,F,=,KI,a,由朗伯,-,比耳定律：,I,a,=,I,0,(1-10,-,cl,),F,=,K,I,0,(1-10,-,cl,)=,K,I,0,(1-,e,cl,),浓度很低时，将括号项近似处理后：,F,=2.3,K,I,0,cl,=,Kc,注意：当,cl,时，,F,与,C,不成正比。,第二十三页，共29页。,定量分析方法,校正曲线法,配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的荧光强度,F,，作校正曲线,F-C,图，根据待测溶液的,F,x,值，在图中求出待测液的,C,x,。,若空白溶液的荧光强度不能校正到,0,，则须作,（,F-F,0,）,-C,图。,第二十四页，共29页。,定量分析方法,比例法,联立方程法,第二十五页，共29页。,荧光计,光 源,第一单色器,或滤光片,样品池,检测器,第二单色器,或滤光片,记录仪,激发,荧光,滤光片荧光计,滤光片,-,单色器荧光计,荧光分光光度计,氙灯,高压汞灯,染料激光器,光电,倍增管,第二十六页，共29页。,荧光法应用,1.,无机化合物的分析,与有机试剂配合物后测量；可测量约,60,多种元素。,铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；,氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；,铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；,铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；,铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,第二十七页，共29页。,荧光法应用,2.,有机化合物的荧光分析,荧光分析法主要应用于有机物、生化,物质、药物的测定（,200,多种），包括：,有机化合物,如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。,药物,如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。,维生素,如：维生素,A,、,B,1,、,B,2,、,B,6,、,B,12,、,E,、,C,、叶酸 等。,甾体、抗生素、酶、辅酶 等。,第二十八页，共29页。,荧光分析新技术,激光荧光分析,时间分辨荧光分析,同步荧光分析,胶束增敏荧光分析,第二十九页，共29页。,