单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单克隆抗体知识,1,单克隆抗体知识1,抗体是具有,4,条多肽链的对称结构，其中,2,条较长、相对分子量较大的相同的重链（,H,链）；,2,条较短、相对分子量较小的相同的轻链（,L,链）。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由,4,条多肽链构成的单体分子。轻链有,和,两种，重链有,、,、,、,和,五种。,整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“,Y”,的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由,17,个氨基酸残基构成，少则只有,2,3,个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。,一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段（,antigen-binding fragment,Fab,）。,Y,的柄部称结晶片段（,crystalline fragment,FC,），糖结合在,FC,上。,抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白,抗体的基本知识,2,抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大,抗体结构图,抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白,抗体的作用机制：抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应及补体依赖性细胞溶解作用,3,抗体结构图抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白,单克隆抗体的制备方式：,1,传统的单克隆抗体制备方法,2,基因工程单克隆抗体制备方法,3,未来单克隆抗体的发展方向,4,单克隆抗体的制备方式：4,传统的单抗制备方法,5,传统的单抗制备方法5,单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于,鼠源性,，,鼠源性单抗应用于人类,的临床应用结果反映出了单克隆抗体药物存在的一些问题,:,(1),鼠,源,性单抗容易容易产生,人抗鼠抗体,(HAMA),在体内作为,异源蛋白,被清除掉，从而削弱其治疗的有效性。,(2),鼠源性单抗在人体内,生物活性降低，,不能有效地激活人体的生物效应。,研究背景,因此，,人们一直致力于人源性抗体的研究,。,6,单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医,人源化治疗性单克隆抗体的研究进展,构建的基本思路,鼠抗体人源化就是通过,基因改造,，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导,HAMA,（人抗鼠抗体）反应。,遵守两个原则,首先，要保持抗体的亲和力和特异性；,其次，要降低或消除抗体的免疫原性。,7,人源化治疗性单克隆抗体的研究进展构建的基本思路 鼠抗体,以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的,DNA,，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库。,以该技术制备的,抗体片段,(Fab),是人源抗体,，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。,解决方案：,（,1,）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；,（,2,）用,EB,病毒转化人的,B,淋巴细胞；,（,3,）用基因工程法制备嵌合抗体等。,效果不强,（,4,）最新方法：,抗体库筛选技术和转基因鼠技术,8,以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质,单克隆抗体的发展史,第一代：鼠源性单抗,药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。,不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆抗体药物中使用。,第二代：人鼠嵌合性单抗,进行人源化改造，使其人源化程度达到,70%,左右。,第三代：,CDR,移植抗体和,SDR,移植抗体,人源化程度达到,95%,左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化单抗,2002,年，的世界首个药物,阿达木单抗上市。人源化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗,。,9,单克隆抗体的发展史第一代：鼠源性单抗 药物特异性很强，副,鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的,B,细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。,嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人,-,鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（,ADCC,）等。,人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，,CDR,）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。,全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、,EBV,转化,B,淋巴细胞技术、噬菌体显示技术（,phage display,）、转基因小鼠抗体制备技术（,transgenic mouse,）和单个,B,细胞抗体制备技术等。,10,10,11,11,1.,嵌合抗体（,Chimeric antibody),用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由,鼠的可变区,和,人的恒定区,组成的嵌合抗体。,由于嵌合抗体可变区（,V,）约占整个抗体的,30%,，鼠源性抗体,V,区中的框架区（,FR),仍残留一定的免疫原性，可诱导,HAMA,反应。,灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于其抗体的可变区与人可变区无差异，不至于发生抗体反应。,缺点,解决方案,鼠源抗体,嵌合抗体,12,1.嵌合抗体（Chimeric antibody)用人源基因,2.CDR,移植抗体（,CDR grafted antibody),真正意义上的抗体人源化。抗体中除了,3,个,互补决定区,（,CDR,）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到,95%,以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有时异基因的,CDR,人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。,改良方案,进行,SDR,移植改良,嵌合抗体,人源化抗体,3,个,CDR,13,2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody,3.SDR,移植抗体,(SDR grafted antibody),在,CDR,移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密切相关的,SDR,等,少数残基,移植到人抗体相应位置上，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。,14,3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody,4.,全人单克隆抗体（,Fully humaneantibody),它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。,在,HIV,等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。,4.1.,抗体库筛选技术,4.1.1.,噬菌体表面展示技术,鼠源抗体,完全人源化抗体,15,4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody,基本原理和程序,噬菌体抗体库,人免疫细胞基因组,PCR,技术扩增,整套,的抗体重链可变区（,VH,）和轻链可变区（,VL,）基因,噬菌体,DNA,中有抗体基因,外壳表面有抗体分子的表达,克隆并以融合蛋白的形式表达,基因重组,噬菌体重组,DNA,构建,利用抗原,-,抗体特异性,筛选所需抗体并进行克隆扩增,获得可溶性抗体片段,表达,16,基本原理和程序噬菌体抗体库人免疫细胞基因组PCR技术扩增整,2024/11/20,局限性,1.,在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。目前，常用的噬菌体展示文库容量在,10,9,。,2.,不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需要外加选择压力。,3.,噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限制了文库中分子遗传的多样性。,4.,因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子,),很难得到有效表达和展示。,17,2023/10/8局限性 1.在噬菌体展示过程中涉及细,4.1.2.,核糖体展示技术,基本原理和程序,人免疫细胞基因组,EDTA,体外转录、翻译、偶联,mRNA-,核糖体,-,蛋白质三聚体,核糖体展示的蛋白文库,构建,基因型和表型联系,利用抗原,-,抗体特异性,筛选所需抗体复合体,EDTA,解离,获得特异,mRNA,RT-PCR,RT-PCR,特异抗体,DNA,子文库,获得特异性的、高亲和力的抗体,表达,18,4.1.2.核糖体展示技术基本原理和程序人免疫细胞基因组E,2024/11/20,传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文库筛选效率。,核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用,mRNA,的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它,大大的提高了文库容量和筛选通量（,10,12,-10,14,）而且能够增加表达的蛋白质的溶解度。,优势,19,2023/10/8 传统的筛选技术具有本身难以克,4.2.,转基因小鼠,通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人,DNA,片段具有完善的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。,案例,：,日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人,14,号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。,但迄今尚无该技术生产的制品问世。,20,4.2.转基因小鼠 通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失,4.3.,微胞杂交干细胞技术,日本学者,Ishida,等首先提出,技术要点：,首先将抗,G418,的人成纤维细胞与小鼠的,A9,细胞融合，通过筛选，得到抗,G418,的小鼠,A9,细胞，再运用,PCR,或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理,48h,，然后用细胞松弛素,B,处理并高速离心，分离出含,2,号、,14,号、,22,号染色体的小鼠,。,人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。,21,4.3.微胞杂交干细胞技术日本学者Ishida等首先提出,4.4.,其他方法,XTL,生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。,22,4.4.其他方法 XTL生物制药公司使用一种类似于人骨,2024/11/20,近年来,人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来了新的希望,当前正处于临床研究的多种抗体中,嵌合抗体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于,70%,。目前的人源化抗体,主要用于,肿瘤,、,自身免疫性疾病,和,心血管疾病的治疗,以及,抗移植排斥反应,和,抗病毒感染,等方面。,人源化抗体的临床应用,23,2023/10/8近年来,人源化抗体和人抗体的出现为临床应,1.,在,肿瘤治疗,方面的应用,:,单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。如,2005,年我国开发出癌症治疗药,重组人,源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体,(,商品名：泰欣生,),。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高,30%,以上。,2.,在,器官移植,中的应用,:,近年来,利用抗体药物作