,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,垂直电泳分离同工酶,（活性染色鉴定法）,垂直电泳分离同工酶（活性染色鉴定法）,1,实验目的,：,理解同工酶的概念及遗传学意义,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术,掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色,实验目的：理解同工酶的概念及遗传学意义,2,同工酶,是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同.,由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。,本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定,同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃,3,乳酸脱氢酶,用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组,织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚,体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同 同工酶的,免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。,LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形,成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交,而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体,乳酸脱氢酶用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎,4,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 净电荷,5,实验器材,：,夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳,压电源（电压300-600V，,电流50-,100mA），移液枪（各种量程），烧杯,（100mL），培养皿,实验器材：,6,实验流程,试剂的配制,仪器的准备,动物组织的样品的获取,分离胶（30分钟）,浓缩胶（30分钟）,电泳（2-3小时）,染色（30分钟）,观察结果,实验流程试剂的配制,7,一,、,试剂：,1.凝胶储备液：,储备液：,pH8.9 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加双蒸水到 80ml，调节pH到8.9定容到100ml。,储备液：,pH6.7 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。,储备液：,分离胶储备液（30%Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4存放可以保存1个月。,储备液：,浓缩胶储备液：10g Acr，2.5g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4可以保存1个月。,储备液：10%Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20保存。,储备液：40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。,TEMED,2.电泳缓冲液：,Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用时稀释10倍。,一、试剂：,8,样品制备,取材：大黄鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.鳃、4.肌肉、5.脾、6.鳍、7.肝、8.心脏放入冰箱保存。,提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0)此溶液需预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为：5,用研钵研磨充分。浆液离心约分钟，转分钟。,取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加ul 甘油,和ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。,样品制备取材：大黄鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.,9,分离胶的制备,将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使用。,储备液,A储备液,C储备液,E储备液,双蒸水,TEMED,总体积,用量（ml）,2.5,3.75,0.1,13.75,10ul,20,配方表,分离胶的制备储备液A储备液C储备液E储备液双蒸水TEMED总,10,浓缩胶的制备,TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约2.0CM左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成。再放置3060min后可以使用。,加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用。,储备液,B储备液,D储备液,E储备液,F储备液,双蒸水,TEMED,总体积,用量（ml）,1.25,0.8,60ul,5,2.9,16ul,10,配方表,浓缩胶的制备储备液B储备液D储备液E储备液F储备液双蒸水TE,11,点样,加样,样品迁移方向,点样加样样品迁移方向,12,电 泳,电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压180V.电流流1830mA,溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约2-3个小时,电 泳,13,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳示意图,夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽,14,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝,15,乳酸脱氢酶染色剂的配制,乳酸钠 0.5ml,NAD 25mg,PMS 2mg,NBT 15mg,0.2M TrisHcl溶液（PH8.0）10ml,去离子水定容至50ml,乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸钠 0.5ml,16,染色与观察,将胶从中间切成2块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下，,置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染,染色剂浸没，避光于37度摇床中染色30min。,观察拍照,染色与观察将胶从中间切成2块，各自切去一个小角（作为标记），,17,同工酶实验宁波大学课件,18,思考题：,根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是,为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？,思考题：根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板,19,谢谢,谢谢,20,