单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验四、细胞培养使用液的配制,11/20/2024,一、实验原理：细胞培养的营养条件,体外培养细胞所需营养物质与体内根本相同，但需求的量与代谢方式与体内细胞不尽相同,11/20/2024,1.细胞培养所需根本物质,1水,2 无机盐,3 糖类,4 氨基酸,5 维生素,6 促生长因子,11/20/2024,糖类-,葡萄糖,细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量。,与蛋白质和脂类共同构成结构材料和生物活性物质。,体外培养动物细胞时，常以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。,植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。,11/20/2024,氨基酸,常需要以下12种氨基酸：,精氨酸、胱氨酸,、,异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、,酪氨酸,、,苯丙氨酸,和,缬氨酸,另外所有细胞都需要,谷氨酰胺,，其具有特殊作用促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。,11/20/2024,2.培养用液,培养用液包括：培养液基、缓冲液、平衡盐溶液、血清及消化液、pH调节液和抗生素等。,1水与平衡盐溶液,体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。最低质量要求为电阻率在1X106 以上。,11/20/2024,常用的平衡盐溶液有Hanks BSS，Earle BSS等,注意,：,一些BSS含有Ca,2+,、Mg,2+,，它们是细胞膜的重要组成成分，又参与许多细胞功能活动，但它们有使细胞凝集的作用，在配制分散细胞的消化液和特殊用途的细胞洗涤时，宜采用无Ca,2+,、Mg,2+,的D-Hanks 液或PBS,。,11/20/2024,2培养基,培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。,天然培养基,常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液如鸡胚和牛胚浸液、鼠尾胶原等。,优点：营养成分丰富，培养效果好,缺点：来源受限。,成分复杂。,易发生支原体污染,11/20/2024,血浆,:,鸡血浆的使用较早，,含有多种化学物质，其中包括：水(91%)、蛋白质(7%)、脂质(1%)、糖类(0.1%)、无机盐类(0.9%)、代谢产物：尿素、肌酐、尿酸等。,血浆蛋白,有白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原三类。当,与鸡胚胎汁混合后发生凝固，构成细胞生长的环境，有利于细胞向三维空间生长。缺点；易于液化。,鸡胚浸出液,：含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有刺激细胞生长作用，为早年培养使用的培养用液，现已被合成培养液所代替。,11/20/2024,水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸。,胶原：细胞生长的良好基质，利于细胞附着，改善细胞外表性质，利于细胞生长。,血清：天然培养基中最重为重要和组织培养中最常使用的天然培养基。含有多种不可缺少的能维持细胞生长增值的成分。,11/20/2024,血清主要成分分类,多种蛋白质白蛋白、球蛋白、铁蛋白等,多种金属离子,激素；,促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。,各种生长因子,未知成分,11/20/2024,血清的主要成分及含量,11/20/2024,细胞培养中使用血清也有弊端,对大多数细胞来说血清不是它们接触的生理学液体。,含有一些对细胞会产生毒性的物质，如多胺氧化酶、补体、抗体等。,每批血清都有差异，其成分不能保持一致。,取材过程有可能带入支原体、病毒。,11/20/2024,血清的质量标准,理化性质：重要指标球蛋白和血红蛋白含量。,微生物检测：细菌、真菌、病毒、支原体等,促细胞生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。,11/20/2024,血清的使用与储存,使用前处理：5630分钟 灭活补体。,储存条件：20保存，防止反复冻融。,使用浓度：一般为520，最常用是10。,出现絮状沉淀物的处理：直接使用或离心。,11/20/2024,合成培养基,目前已设计出许多种培养基，如DMEM、RPMI-1640、TC199、MEM等。,成分：必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。,常需要添加的成分：NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等,优点：标准化生产，组分和含量相对固定。本钱低,缺点：不能完全满足体外细胞生长需要。只能维持细胞生存，常需补充一定量的天然培养基如血清。,11/20/2024,完全培养基的组成,根底培养基 80一95,血清 5一20,碳酸氢钠 2.0 g/L,青、链霉素 各100单位毫升,11/20/2024,3消 化 液,胰蛋白酶,胰蛋白酶是一种黄白色粉末，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。,用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25，pH8.0。用滤器过滤除菌。,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞别离。,胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,11/20/2024,EDTA溶液,：解离细胞，常用浓度0.02%，与胰酶,混合使用,胶原酶溶液,：用于上皮细胞的原代培养，作用于,胶原，对细胞影响很小。,11/20/2024,4 pH调整液,NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH到达设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换到达平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求参加NaHCO3。此时常用5.6%or 7.4%的NaHCO3溶液调节培养基，使之到达所要求的pH环境。,11/20/2024,HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌嗪乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，假设加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。,11/20/2024,培养基配制应注意的问题,认真查看说明书成分、本卷须知,器皿要灭菌,加温去离子水灭菌至15-30度,参加培养基干粉，搅拌至溶解,参加须补充的成分、NaHCO3、调节pH后定容,用0.22 m以下孔径的微滤膜过滤,分装，4 度储存，用时参加血清终浓度 10,11/20/2024,二、实验目的,1.掌握DMEM培养基、胰酶的配制,2.学习,针头滤器的使用方法,11/20/2024,三、实验步骤,(一 DMEM培养基的配制,1.水的准备,11/20/2024,2.3袋DMEM粉末用双蒸水溶解、磁力搅拌器搅拌半小时以上。,11/20/2024,参加3.6g NaHCO3，定容至3000 mL、搅拌30分钟。,4.每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。留取少许做污染测试放CO2培养箱72小时,每8个人为一组，每人过滤90 mL。,11/20/2024,下周使用前在超净台内参加FCS 胎牛血清10 mL，使血清的终浓度为10%，4保存待用。,11/20/2024,二胰酶的配制,1.取无菌的DHanks 液200 mL 8人一组,2.称取0.5g胰酶0.25%，在超净台中移至无菌的研磨器中，加少量0.5毫升D Hanks液研磨,200次/人，使成为糊状Ice Cream 样(夏天时研磨器应放在冰浴中),11/20/2024,3.参加D Hanks液约150mL，加EDTA至0.02%(质量/体积,2%母液加2mL用NaHCO3 调pH至8.0。边调pH边磁力搅拌使EDTA完全溶解。,4.用一次性针头滤器过滤除菌至小瓶内、贴好标签、-20保存。每人过滤20 mL，每个超净台使用一个滤器，滤器在同学间转移时要注意无菌操作。,11/20/2024,三准备工作,1.解剖器械清洗,2.包冻存管，灭菌,11/20/2024,四、思考题,1.细胞培养中为什么添加血清？,2.消化液胰酶的浓度是多少？,3.过滤除菌应注意的问题？,11/20/2024,