,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,实验目的,了解电泳实验原理,掌握电泳实验操作规程,用电泳方法测定蛋白分子量,实验目的,电泳,是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。,电泳技术,指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,电泳基本原理：,电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的,COO-COO-COOH,+H,+,+H,+,Pr ,Pr ,Pr,+OH-+OH-,NH,2,NH,3,+,NH,3,+,PHPI PH=PI PHPI,电泳用于分离物质的原理：,电泳用于分离物质的原理：,带电颗粒在电场作用下所受的力：,电场力,F=XQ,阻力,F=6,当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动,:,F=F,QX=6,/X=Q/6,带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力 F=XQ阻力 F=,影响电泳速度的因素：,样品本身：带电量，分子大小，形状,电场强度：电压,缓冲液：成分，,pH,，离子强度,支持介质：电渗作用，吸附作用,温度,影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状,分类,连续电泳,不连续电泳,非变性电泳,变性电泳,分类连续电泳,1.,连续系统：,缓冲液的离子成分、,PH,、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有,电荷效应、分子筛效应,。,2.,不连续系统：,缓冲液离子成分、,pH,、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有,浓缩效应,、,电荷效应、分子筛效应,。,分类,1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相,分子筛效应：,分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。,电荷效应：,电荷量不同，迁移率不同。,分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分,（,1,）,缓冲液离子成分、,PH,的不连续性：,电极缓冲液的,pH=8.3,，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。,（,2,）,凝胶孔径的不连续性：,在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。,浓缩效应,（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳课件,成分,pH,值,孔径,电泳缓冲液,甘氨酸,(,慢离子,),8.3,样品,蛋白质,6.7,浓缩胶,Cl,-,(,快离子,),6.7,大,分离胶,Cl,-,(,快离子,),8.9,小,成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.,浓缩效应,电荷效应,分子筛效应,不连续电泳三大效应：,浓缩效应不连续电泳三大效应：,非变性电泳,变性电泳 测定亚基分子量,非变性电泳,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,:,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进,SDS,（十二烷基磺酸钠）,1967,年，,Shapiro,等人首先发现，如果在,聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统中加入一定量的,SDS,，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SD,SDS,是一种阴离子去垢剂，,SO,3,2-,带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的,SDS,溶液中与,SDS,分子结合时，可形成,SDS-,蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的,SDS,，好比蛋白质穿上带负电的,“,外衣,”,，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于,蛋白质,分子大小,SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含,当蛋白质的分子量在,15,000,200,000,之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。,符合如下方程式：,Lg MW =,b,m,R,+K,其中，,MW,为蛋白质的分子量，,m,R,为相对迁移率，,b,为斜率，,K,为截距。当条件一定时，,b,与,K,均为常数,因此通过,已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,使用含有十二烷基硫酸钠（,SDS,）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸,3,5,分钟），通过加热和,SDS,可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。,经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于,SDS,是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，,SDS,通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合,SDS,的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的,SDS,。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,垂直板电泳装置加样样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量,。,相对迁移率,标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶,等电聚焦电泳（,IFE,）,利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个,pH,梯度。,每种蛋白质都将迁移至与它的,pI,相一致的,pH,处。,凝胶中加有两性电解质溶液（,pH9-3,）,加电场后在凝胶内形成一个稳定,pH,梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自,pI,值沿着,pH,梯度分布,等电聚焦电泳（IFE）凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-,双向电泳,第一向,：,等电聚焦电泳,第二向,：,SDS-PAGE,双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：,水平方向反映出蛋白在,pI,上的差异，,垂直方向反映出它们在分子量上的差别,。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在,SDS,凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：,SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH3,pH9,pH,3,双向电泳第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,单体：丙烯酰胺（,Acr,）；,交联剂：甲叉双丙烯酰胺（,Bis,）；,催化剂：过硫酸胺或核黄素；,加速剂：四甲基乙二胺（,TEMED,）；,产物：三维网状结构凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶（,polyacrylamide gel,PAG,）的聚合反应：,单体：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰胺凝胶（polyacryl,操作过程,1.,将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备,2,个干净的小烧杯,2.,把玻璃板在灌胶支架上固定好,操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小,分离胶,(,10%10ml,),浓缩胶,(5%10ml),ddH,2,O,4.05ml,6.8ml,30%Acr,3.3ml,1.7ml,Buffer,1.5mol/L pH=8.8,Tris-HCl 2.5ml,0.5mol/L pH=6.8,Tris-HCl 1.25ml,10%SDS,100,l,100,l,10%Ap,50,l,100,l,TEMED,10,l,10,l,配 胶,分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)dd,3.,按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约,5,厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝,*凝胶配制过程要迅速,催化剂,TEMED,要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒,*,水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面,4.,倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘,5mm,处,迅速插入梳子,静置到胶凝 *梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,5.,拔出样梳后,在槽中加入缓冲液,*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝,6.,上样：,（,1,）,marker 5,l,（,2,）样品,10,l+2,上样,buffer 10,l,共,20,l,100,沸水浴，,3-5min,？（蛋白变性）,7.,微量注射器（加样器）上样,上样量,15,l *,微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,6.上样：,8.,电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在,10mA,（,120V,），当进入分离胶后改为,20mA,（,180V,），溴酚蓝距凝胶边缘约数,cm,时，停止电泳,9.,凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色,1,小时左右,10.,脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰,*,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,11.,实验结果分析,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流,按下式计算相对迁移率：,每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性,=,蛋,白,样,品,距,加,样,端,迁,移,距,离,c,m,溴,酚,蓝,区,带,中,心,距,加,样,端,距,离,c,m,相,对,迁,移,率,按下式计算相对迁移率：=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝,