,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,常规标本的制作和,HE,染色,薛辉,吉林大学基础医学院,切片的一般程序,封固,石蜡切片,取材,固,定,(24-48h),脱,水,(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2),透,明,(,二甲苯,10min(2),浸,蜡,(30min(3),包埋,切片,染色,显微标本制作技术,从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法,来分，有涂片、压片、装片,(,也叫整装法,),、磨片和切片等,。,切片法,徒手切片法,石蜡切片法,火棉胶切片法,冰冻切片法,材料和夹持物,切取的标本,1.徒手切片法,滴水,放置标本,加盖盖玻片,叶的横切,取 材,1.,材 料 新 鲜 最 好 是 动 物 的 心 脏 还 在 跳 动 时 取 材，立 即 投 入固 定 液 内。应 争 取 在 死 后 半 小 时 内 处理 完 毕,2.,组 织 块 力 求 小 而 薄,以 不超 过,5,毫 米 为 在 可 能 范 围 内 也 应 力 求 短 小。以 使 固 定液 能 迅 速 而 均 匀 地 渗 入 组 织 块 内 部,3.,勿 使 组 织 块 受 挤 压。取 材 时，组 织 块 可 稍 取 大 一 点。,4.,要 熟 悉 取 材 的 部 位 要 能 准 确 地 按 解 剖 部 位 取 材，如 胰腺，一 般 取 胰 岛 较 多 的 胰 腺 尾 部，脊 髓 取 腰 膨 大 与 颈 形 大,5.,选 好 组 织 块 的 切 面 纵 切 或 横 切 往 往 是 显 示 组 织 结 构 明 晰 的 关键。,6.,保 持 材 料 的 清 洁 组 织 块 上 如 有 血 液、污 物、粘 液、食物、粪 便 等，可 用 生 理 盐 水 冲 洗，然 后 再 入 固 定 液，但 要 注 意 防止 组 织 损 伤。,空腔性器官,注意横断面和纵断面 保护内皮和粘膜,横断：气管、食管、血管,纵断：胃底、肠、心脏,心瓣膜,左心室,左心房,特殊的组织或者器官,血液、骨髓：涂片,肌肉、神经：,骨、牙齿：脱钙 切片,酸,固 定 的 方 法,1.,蒸 气 固 定 法 比 较 细 小 而 薄 的 标 本，可 用 饿 酸 或 甲 醛 蒸 气,固 定。主 要 用 于 血 液 或 细 胞 涂 片 以 及 某 些 薄 膜 组 织 等 的 固。如血液 涂 片，则 应 在 血 片 未 干 燥 前 就 与 饿 酸 蒸 气 接 触,2,注 射、灌 注 固 定 法,.,某 些 组 织 块 由 于 体 积 过 大 或 固 定 掖,极 难 渗 入 内 部 或 需 要 对 整 个 脏 器 或 整 个 动 物 进 行 固 定。,如 肺 可 将 固 定 液 从 气 管 或 支 气 管 注,入,.,全 身 灌 注 固 定 较 大 动 物如 兔、猫、狗、猴 及 整 个 人 体,固 定 液 输 入 后，可 不 必 即 刻 取 材。小 动 物，如 大、小 鼠，也可灌流固定,.,3.,小 块 组 织 固 定 法,.,从 人 体 或 动 物 取 下 的 小 块 组 织，须 立,即 置 入 液 态 固 定 剂 中 进 行 固 定，这 是 应 用 最 广 泛 最 经 常 的 方 法。,固 定 的 目 的,1.,迅 速 阻 止 组 织、细 胞 的 死 后 变 化，防 止 自 溶 与 腐 败，使 之尽 量 保 持 生 前 的 状 态 与 结 构。,2.,使 细 胞 内 的 蛋 白 质、脂 肪、糖，酶 等 成 分 转 变 为 不 溶 性物 质，以 保 持 其 原 有 状 态。,3.,使 组 织 内 各 种 物 质 成 分 产 生 不 同 的 折 光 率，以 便 染 色 后 易于 鉴 别 和 观 察,4.,使 组 织 块 在 脱 水、包 埋、切 片、染 色 等 过 程 中 不 易 损 坏。,5,使 不 同 组 织 成 分 对 染 料 有 不 同 的 亲 和 力，经 过 染 色 处 理 后易 于 辨 认。,6.,防 止 细 胞 过 度 收 缩 或 膨 胀 而 失 去 其 原 有 形 态 结 构。,7.,使 组 织 块 硬 化，便 于 制 作 薄 片。,注 意 事 项 及 影响 固 定 的 因 素,1.,组 织 块 不 宜 过 大，一 般 以 厚 度,5,毫 米，长 宽 不 超 过,15x15,毫 米。,2.,固 定 液 的 量 一 般 以 组 织 块 大 小 的,20,倍 为 宜,3.,必 须 选 择 渗 透 力 强，又 不 使 组 织 过 度 收 缩 或 膨 胀 的 试 剂做固定剂,.,石蜡切片标本的固定,固定液：,10%,中性福尔马林,固定时间：室温,3,个小时，,1,个小时后修块。,固定方法：,容器底部垫上脱脂棉或者滤纸。,肺脏：液体表面覆盖脱脂棉。,空腔脏器：浆膜面平铺在纸板上用大头钉固定。,胆囊放在单独的容器内。,脑、脊髓、松软的肿瘤、病变组织：先固定后切开。,脑最好悬吊在固定液中。,睾丸、囊性组织：向腔内注入较高浓度的固定液。,骨骼标本：剥离软组织后锯成小块固定。,垂体等较小组织：擦镜纸包好滴少量伊红标记后固定。,冲洗和保存,经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水,洗，否则影响核的染色。,一般置于,7080%,酒精中,4,0,C,保存。当酒精混浊时，更换新的酒精。,固定易出现的问题与主要原因,扭曲变形与过度硬脆,容器过小；标本数量过多；固定时间过长。,取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。,表层过度，中间没有固定透,取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。,固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。,局部固定不佳,组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。,注意：根据实验目的不同选择适当的固定液。,脱水,（一）脱 水 的 意 义 与 目 的,常 用 的 固 定 剂 中 含 有 很 多 水 分，在 石 蜡 或 火 棉 胶 包 埋 前。必 须,用 某 些 溶 剂 逐 步 将 组 织 块 吸 收 的 水 分 置 换 出 来，再 让 石 蜡 或 火 棉,胶 将 该 溶 荆 里 换，完 成 包 埋 步 骤。将 组 织 块 内 水 份 置 换 的 过 程 就,叫 脱 水。,脱 水 时 必 须 由 低 浓 度 脱 水 剂 开 始，逐 步 转 入 高 浓 度 脱 水 剂，,以 防 组 织 过 度 收 缩 而 变 形，或 脱 水 不 完 全 而 影 响 制 片 效 果。,脱 水 剂 必 须 具 有 下 列 特 性：脱 水 剂 能 与 水 按 比 例 混 合，,高 浓 度，一 般 指 不 含 水 份，脱 水 剂 也 能 与 透 明 剂混 合。前二者特 性 能 达 到 逐 步 除 去 组 织 块 内 的 水 份，使 组 织 块 内 的 水 份 全 部 被脱 水 剂 所 取 代，后二者 特 性 则 为 透明步骤的 透 明 剂 完 全 取 代 组 织,内 的 脱 水 剂 创 造 条 件。,脱 水 时 间 应 视 组 织 块 的 大 小 及 厚 度 而 定，大 致 处 理 如 下：组,织 块 为,3-5,毫 米 厚 者，各 级 酒 精 为,3-6,小 时，无 水 酒 精 对 组 织,有 脆 化 作 用，浸 泡 时 间 还 应 缩 短。实 质 性 器 官，如 肾、脾 和淋 巴 结 等，在 酒 情 中 浸 泡 时 间 太 久 易 于 硬 脆，脂 肪 组 织 与 疏 松 结缔 组 织 在 酒 精 中 浸 饱 的 时 间 要 长，特 别 是 在,95,酒 精 中，以 尽 量溶 去 脂 肪，并 脱 净 残 存 的 水 份，有 利 于 包 埋 剂 渗 入 组 织 内。,脱水,目的：利于石蜡包埋剂渗入。,酒精脱水：,70%,和,80%,：可以长期保存,90%,、,95%,：,2,个小时。,100%I,、,II,：各,1,小时。,注意：,某些检查，不能经过低浓度酒精脱水。如糖原、尿酸结晶。,肝、脾、淋巴结：适当缩短在无水乙醇内的时间。,脂肪、疏松结缔组织、脑：适当延长脱水时间。,透 明,二甲苯,I,和,II,：各,10,分钟左右。,透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。,透明 透明在两种情况下进行。,第一,，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明剂。,第二,，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透明而便于观察的作用。,浸 蜡,透蜡 是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。,浸 蜡,石蜡熔点选择,5458,0,C,，浸蜡温度较熔点高,23,0,C,。,较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。,疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝脾选用熔点较低的石蜡。,石蜡,I,：,1020,分钟。,石蜡,II,：,2030,分钟。,石蜡,III,：,3040,分钟。,包 埋,是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。,包 埋,新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质地均匀。,包埋温度,6570,0,C.,准备工作 熔蜡备用；预热包埋用具,注蜡、取放组织 切面向下,摆正压平 保留适当距离,附贴标记,移置冷凝,修整蜡块,粘贴标记,包埋,修块,石蜡,注意事项,实质性器官：最大切面向下。,空腔性器官：管壁切面向下,相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块中。,难切的组织单独包埋。,操作要迅速，组织不能在空气中停留太久。,石蜡切片,准备工作,切片 通常,46,微米,展片,55,0,C,附贴 蛋白甘油,标记 连续切片标记顺序,烤片,60,0,C,石蜡全部融化,切片,56,m,展片与粘片,水内捞片法：40,酒精捞片法：5070%酒精，3040,烤片,60 烤箱烤干,HE,染色,封固,干封,湿封,冰 冻 切 片,取材,脱水,10%,蔗糖,20%,蔗糖,30%,蔗糖,OCT,包埋 浸泡,2030,分钟,-70,0,C,冷凝 液氮液面上,1020,秒,-70,0,C,保存,冷冻切片,-20,0,C,保存,1,个月,干燥 室温,10,分钟,固定 冷丙酮,510,分钟,染色,