单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,整理版,*,高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用,陈 檬,S,1030624,张双,健 S,1030621,郭传龙,S,1030622,石晨阳,S,1030623,汪菊芬,S,1030625,1,整理版,高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用陈 檬 S10,高效液相色谱技术特点概述,1,HPLC,系统各组分介绍；,2,流动相的要求及准备过程,3,5,4,HPLC,色谱技术与其他技术联用,5,HPLC,应用举例,6,现状与展望,6,2,整理版,高效液相色谱技术特点概述1HPLC系统各组分介绍；2流动相的,应用,范围广,高灵,敏度,高效,高压,分析速,度快,HPLC,是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。,特 点,3,整理版,应用高灵高效高压分析速HPLC是近二十年来发展起来的,根据分离机理蛋白质,HPLC,又可分为,1,2,4,3,高效凝胶过滤色谱,(HPSEC),高效离子交换色谱（,HPIEC,）,高效亲和色谱（,HPAFC,）,反向高效液相色谱（,RP-HPLC,）,4,整理版,根据分离机理蛋白质HPLC又可分为1243高效凝胶过滤色谱(,高效液相色谱仪,5,整理版,高效液相色谱仪5整理版,常用的HPLC仪,Waters公司,Agilent公司,岛津公司等,6,整理版,常用的HPLC仪 Waters公司 6整理版,一,进样系统,进样方式,隔膜进样,*阀进样,自动进样,停流进样,7,整理版,一 进样系统进样方式隔膜进样*阀进样 自动进样 停流进,六通阀进样,高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器,。,上样,分析,8,整理版,六通阀进样 高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆,开始分析,废液,样品,淋洗液,至分离柱,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,定量环进样,（）,（）,样品环,9,整理版,开始分析 废液样品 淋洗液 至分离柱进样阀 样品 装样 废,进样方式,部分装液法,进样量应不大于定量环体积的,50%,（最多,75,），并要求每次进样体积准确、相同。,缺点是易产生由进样引起的峰展宽,完全装液法,进样量应不小于定量环体积的,510,倍（最少,3,倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性,10,整理版,进样方式 部分装液法进样量应不大于定量环体积的50%（最多7,二,输液系统,在线脱,气装置,梯度仪,高压输,液泵,输液系统,11,整理版,二 输液系统在线脱梯度仪高压输输液系统11整理版,高压输液泵,输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。,流量稳定,流量范围宽,输出压力高,液缸容积小,密封性能好，耐腐蚀,12,整理版,高压输液泵 输液泵是HPLC系统中最重要的,柱塞往复泵,流量不受柱阻影响,泵压可达400kg/,cm,2,输出的脉冲性较大，现多采用双泵,系统来克服,液缸容积小，可至,0.1ml,，因此易于清洗更换流动相，特别适合再循环和梯度洗脱,13,整理版,柱塞往复泵流量不受柱阻影响泵压可达400kg/cm2输出,三,分离系统,分离系统,*色谱柱,连接管,恒温器,14,整理版,三 分离系统分离系统*色谱柱连接管恒温器 14整理版,色谱柱,柱效高,选择性好,分析速度快,15,整理版,色谱柱柱效高15整理版,进入色谱柱样品的处理,16,整理版,进入色谱柱样品的处理16整理版,柱的使用和维护注意事项,色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。,避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。,应逐渐改变溶剂的组成。,一般说来色谱柱不能反冲,，,会迅速降低柱效。,17,整理版,柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要,选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。,经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。,柱的使用和维护注意事项,18,整理版,选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。,四,检测系统,19,整理版,四 检测系统19整理版,要求,灵敏度高,噪音低,适用范围广,重复,性好,20,整理版,要求灵敏度高 噪音低 适用范围广重复20整理版,UV,检测器,21,整理版,UV 检测器21整理版,数据处理和计算机控制系统,恒温装置,在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在0.10.5之间，检测器的恒温要求则更高。,采集处理分析数据,控制,仪器,色谱系统优化,22,整理版,数据处理和计算机控制系统恒温装置 在HPLC仪中色谱柱及,流动相的要求,反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇,-,水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈,-,水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足,185-205nm,处检测的要求。,与检测器相适应,溶剂的纯度,粘度小,沸点低固体残留物少,与色谱系统相适应,23,整理版,流动相的要求反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能,流动相的准备,调整,PH,根据所分离蛋白质及色谱柱决定,流动相脱气,滤膜过滤,目前实验室主要用的是超声,15min,左右,溶剂使用前都必须经,0.45m,滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤,24,整理版,流动相的准备调整PH根据所分离蛋白质及色谱柱决定流动相脱气滤,合适的波长,合适的柱温,蛋白样品的性质,25,整理版,合适的波长合适的柱温蛋白样品的性质25整理版,HPLC,与其他色谱光谱技术的联用,CE,MS,UF,CE,CE,MS,HPLC,26,整理版,HPLC与其他色谱光谱技术的联用CEMSUF CECEMSH,高效液相色谱,质谱,蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。,高效液相色谱,毛细管电泳,当毛细管电泳与,HPLC,联用时，两者各自优势都得以发挥。,HPLCCE,联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离,27,整理版,高效液相色谱质谱高效液相色谱毛细管电泳27整理版,反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定,应用实例,色谱柱,流动相,梯度洗脱,其他,C5,柱,(100 mm*4.6mm5m,，,Ph-enomenex,公司，美国,A,相,:10mmol/L Tris,缓冲液,(pH 8.5),;,B,相,:,乙腈,;,流速,:,1mL/min,B,相体积分数变化为,:0,15 min,15%,25.5%;,15,21 min,25.5%,。,进样量,20,L,柱温,25,28,整理版,反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定应用实例色谱柱流动相梯,29,整理版,29整理版,高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析，对于大样品的分离纯化成本较高且费时，有待进一步优化其条件或找到适于分离纯化蛋白质的方法。,现状与展望,相信随着新的色谱柱和多种手段的联用，高效液相色谱能够在包括蛋白质在内的大分子物质的研究领域里发挥更大的作用,30,整理版,高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析，对于大样品的分离纯化,Thank you,31,整理版,Thank you31整理版,