按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片文字樣式,第二階層,第三階層,第四階層,第五階層,4,分子量,决定法,4.1,胶体过滤,依蛋白,质,分子量的大小,来做,分子量,测定,4.2,梯度,电泳,可,佐证,分子量的,测定,4.3,其它分子量,测定,方法：,4.3.1,超,心法,4.3.2,由,氨,基酸序列,分子量,4.3.3,质谱仪,分析,胶体过滤的分离图谱：,E,(,E),(,Y),X,Y,Z,Vo,Ve,A,Enzyme,activity,Vt,0,Vo,之前不应有,物质溶离出来,Vt,之后不,应有物质,溶离出來,NaCl,Elution Volume(mL),目标酶,最好不要落在,主要蛋白质峰,的范围內,AF IEX GF TP XT,marker,AF IEX GF TP XT,marker,252,kD,98,64,50,36,GUS,252,kD,98,64,50,36,GUS,10%SDS-PAGE,Western Transfer,以,电泳及抗体检定表现蛋白质,1998A C3,纯化步骤顺序,纯化步骤顺序,以,胶体过滤法求得 GUS 原态分子量,5,蛋白,质构造与组成分析,5.1,N-端或 C-端,氨基酸決定：,通常都直接定序，C-端,较为困难,5.2,氨基酸组成分析,5.3,氨基酸定序法：,5.3.1,cDNA,间推法,5.3.2,Edman 直接定序法,5.4,肽谱,5.5,其它,相关方法,以 dansylation 決定 N-端,氨基酸：,只有,Dansylation,HCl hydrolysis,2-,D,Chromatography,N-,terminal,TLC plate,N-,端氨基酸,会被修飾,以紫外线呈色,氨基酸水解液,水解,试剂：,6N HCl 或 4N methanesulfonic acid,水解,条件：,真空下 110 度 24 小,时,检测方法：,以 HPLC(,离子交换法)分离各氨基酸,结果注意：,有些,氨基酸被破坏(Trp),Cys-Cys,断裂成为 Cys,Gln 及 Asn 酸化成,为 Glu 及 Asp,(Glu,Gln Glx;Asp,Asn Asx),蛋白,质的水解,：,5.4,肽谱,：,5.4.1,蛋白,质,的,专一,性水解：,专,一性內切,酶,：,Trypsin,Chymotrypsin,Sa,protease,化,学反应,法：,CNBr,5.4.2,检定肽谱,的方法：,TLE/TLC HPLC SDS-PAGE,蛋白,质的专一性水解：,变,性,蛋,白,质,Proteases,Cutting sites,使用,专一性蛋白酶,6,免疫,学工具的利用,6.1,抗原,制备,6.2,免疫流程,6.3,抗,体制备,6.4,抗,体的应用,免疫,系统：,先天及,后天免疫系统,免疫反,应：,遭遇,动员扫荡休止,抗体分子：,有,两个专一性抗原结合区,单株抗体：,只,对其专一性抗原基作用,免疫,学工具：,2,(,Trial Bleeding),0,4,6,8,NS-1 Cell,10,12,14,wk,同一剂量于,Freunds,Incomplete Adjuvant,spin down cells(,丟弃,),效价测定,X mL (X=1-10),BALB/c,(10,cells),7,Pristane,(0.5,mL),全采血,追加注射至少三次,Ascites,Antigen(50,m,g/mouse),悬浮于,0.5,mL,Freunds Complete Adjuvant,Ascites fluid,使用,TiterMax,次數,可以減半,A,),spin down cells(,丟,弃,+2,X mL PBS,ammonium sulfate(AS),fractionation 0-40%sat.,spin down pellet,Pellet,resuspended in 40%AS,spin down pellet,Pellet,dissolved in X mL PBS,three changes,spin down precipitate,+,glycerol(equal volume),Ascites,dialysis in PBS,IgG(stored in freezer),Supernatant,B,抗体免疫沉淀的原理及应用,7,蛋白,质科技,7.1,蛋白,质科技的范围,7.2,蛋白,质的微量分析及检定,7.3,蛋白,质体研究,蛋白,质科技,Protein Technology,蛋白,质的微量分离及检定,1,电泳及转印,2,二,元电泳,3,胶体内水解,4,微量分,离系统,微量分析,系统,抗,体制备,生物,资讯学,蛋白质纯化,蛋白,质科技,Protein Technology,蛋白,质的定序及抗体流程,1 蛋白,质纯化,2 蛋白,质定序,3 抗,体制备,