Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,4/25/2010,#,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术,主讲人：林宏琳,福建省疾病预防控制中心,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术主讲人：林宏琳福建省疾病预防控制中,1,发表营养与食品安全领域检测技术研究论文40余篇,林宏琳,副主任技师,教师简介,福建省疾病预防控制中心,卫生检验检测所,副主任技师,福建医科大学,公共卫生学院专业及实习基地教研室成员,从事营养与食品安全相关卫生理化检验研究工作近20年,擅长食品中痕量或超痕量物质及活性成分的色谱/质谱分,析技术, 发表营养与食品安全领域检测技术研究论文40余篇林宏琳教师,2,01,02,04,03,目,录,05,EC简介,酒中EC的污染及风险评估,酒中EC预防控制策略,检测方法与技术,分析质量控制,010203目EC简介酒中EC的污染及风险评估,3,氨基甲酸乙酯,ethyl,carbamate,CAS号：51-79-6,分子式：C,3,H,7,NO,2,NH,2,COOC,2,H,5,分子量：89.09,氨基甲酸乙酯ethyl carbamateCAS号：51-7,4,水溶液是中性的,0.48,g/mL,1g的EC溶于,0.8mL,乙醇；0.9,mL,氯仿；1.5,mL,乙醚；,2.5mL,甘油,;,32mL,橄榄油,氨基甲酸乙酯,EC,无味、无色晶体或白色粉末, 水溶液是中性的0.48 g/mL 1g的E,5,项目,内容,沸点,182-184,熔点,48-50,相对密度（水为,1,）,1.1,蒸汽压,Pa,（,25,）,48,相对蒸汽密度（空气为,1,）,3.07,燃烧点,92,表观状态,无色、无味晶体或白色粉末,溶解度,易溶于水、乙醇、乙醚、甘油,EC理化性质,项目内容沸点182-184熔点48-50相对密度（水为1,6,发酵食品（如酒精饮料、酱油、醋、奶酪、面包）中普遍,存在的一种代谢污染物,涉及原料、发酵、贮存等环节,EC的形成,发酵食品（如酒精饮料、酱油、醋、奶酪、面包）中普遍存在的一,7,世界卫生组织国际癌症研究机构,International,Agency,for,Research,on,Cancer，IARC,EC：类致癌物,-,对人很可能致癌,IARC,group,2A,EC污染及风险评估, 世界卫生组织国际癌症研究机构International,8,食品添加剂联合专家委员会（JECFA）评估,EC的基准剂量下线（BMDL）为每天0.3,mg/kg,bw,来自食品和酒精饮料的暴露量为每天80.0,ng/kg,bw（EDI）,EC的食品安全风险主要源于酒精饮料的摄入,需要采取有效措施降低酒精饮料中的EC含量,EC污染及风险评估,食品添加剂联合专家委员会（JECFA）评估EC的基准剂量,9,国家,MRL,加拿大,佐餐葡萄酒30g/L，强化葡萄酒100g/L，蒸馏,酒150g/L，水果白兰地400g/L,美国,佐餐葡萄酒15g/L，烈酒100g/L,日本,清酒100g/L,中国,暂无,酒精饮料中EC最大残留水平（MRL）,国家MRL加拿大佐餐葡萄酒30g/L，强化葡萄酒100g,10,第四次总膳食TDS,第五次TDS,平均人群摄入量为,8.5,g/kg,19.8,g/kg,每天8.27,ng/kg,bw,高暴露人群（97.5百分位数）为每天45.67,ng/kg,bw,我国酒精饮料中EC风险较低，但不排除特殊人群（酗酒者）存在较高风险。,我国酒精饮料中EC的污染及风险评估, 第四次总膳食TDS8.5 g/kg 高暴露人群（9,11,JECFA,EDI,(,80.0,ng/kg,bw,),表明黄酒是酒精饮料中EC的主要暴露来源,我国黄酒中EC污染及风险评估,黄酒高消费地区890份黄酒样品,468种成品酒的EC分布,6.3775.8,g/L,平均含量,232.9,g/L,EC的平均消费人群每日摄入量估计为290.6,ng/kgbw高暴露,人群（97.5百分位数）为每天1848.4,ng/kgbw, JECFAEDI (80.0 ng/kg bw),12,黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制技术措施指南,中华人民共和国国家标准.,GB/T,34266-2017.,黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制技术措施指南中华人民共和国国家标准,13,酒精饮料中的EC来源于前体物质与乙醇的反应，主要的前体物质包,括尿素、氢氰酸、瓜氨酸以及氨基甲酰类化合物等。,黄酒中的EC的主要前体物质为尿素，而尿素源于原料带入以及发酵,过程中精氨酸代谢。,黄酒中EC生成速率与其尿素含量，贮存时间、温度正相关。,EC污染及风险评估, 酒精饮料中的EC来源于前体物质与乙醇的反应，主要的前体,14,原料（大米、麦曲等）,发酵过程（工艺参数）,陈贮阶段（贮存时间和温度）,GB/T,34266-2017,原料（大米、麦曲等）陈贮阶段（贮存时间和温度）GB/T,15,Ethyl,Carbamate,Preventative,Action,Manual, Ethyl Carbamate Preventativ,16,SUMMARY,SUMMARY,17,1,2,3,4,5,气相色谱法（）,AOAC,993.04,气相色谱-质谱法（-）,AOAC,994.07,GB,5009.223-2014,气相色谱-质谱/质谱法（-/）,液相色谱-荧光法（,-,FLD,),GB/T,34266-2017,液相色谱-质谱/质谱法,（-/）,APCI,ESI,6,拉曼散射法,分光光度法,酶联免疫吸附法（ELISA）,其它,傅立叶变换红外光谱法,核磁共振光谱偏最小二乘法,薄层色谱法,检测方法,12345气相色谱法（）气相色谱-质谱法（-）,18,气相色谱法（）,气相色谱法（）,19,气相色谱质谱法,（）,食品中氨基甲酸乙酯的测定,.,中华人民共和国国家标准,.,GB,5009.223-2014.,气相色谱质谱法 （） 食品中氨基甲酸乙,20,AOAC,994.07,AOAC 994.07,21,食品中氨基甲酸乙酯的测定.中华人民共和国国家标准.,GB,5009.223-2014., 食品中氨基甲酸乙酯的测定.中华人民共和国国家标准. G,22,AOAC994.07,GB5009.223-2014,内标,氨基甲酸丙酯,EC-D5,溶剂,二氯甲烷,正己烷乙酸乙酯乙醚,浓缩,真空旋转蒸发,氮吹,净化,硅藻土固相萃取柱,硅藻土固相萃取柱,气相色谱质谱法,（）,AOAC994.07GB5009.223-2014内标氨基甲,23,气相色谱串联质谱/质谱法,（/,）,气相色谱串联质谱/质谱法 （/ ）,24,MS与MS/MS的比较,Mass,analyze,Detect,Ionize,Inlet,Fragment,Ionize,Inlet,Detect,MS,Mass,analyze,Mass,Inlet,Inlet,Inlet,analyze,MS2,Collision,Cell,MS1,MS/MS,MS与MS/MS的比较MassDetectIonizeIn,25,液相-荧光法,(LC-FLD),黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制技术措施指南.,中华人民共和国国家标准.,GB/T,34266-2017.,液相-荧光法 (LC-FLD) 黄酒中氨基甲酸乙酯预防,26,液相色谱串联质谱法（/,）,APCI,atmospheric,chemical,ioniza,tion大气压化学离子化,ESI,electrospray,ionization,电喷雾离子化,液相色谱串联质谱法（/ ）APCI at,27,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术课件,28,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术课件,29,离子源,特点,APCI,a.电晕放电离子化，气相离子化,b.小分子，极性小或中等，有一定的挥发性,c.产生单电荷离子,d.可使用较高的LC流速,ESI,a.离子蒸发，液相离子化,b.含杂原子的分子，分子量范围较大、有一定极性,c.可生成一系列多电荷离子,d.相对较低的LC流速,离子源特点APCIa.电晕放电离子化，气相离子化ESIa.离,30,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术课件,31,选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中,以,待测组分和对照物质的相应信号对比，测定待测组分含量的方法。,内标法,该对照物质称为内标(InternalStandard,IS), 选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中,32,一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。,内标法抵消了上样体积、流动相、检测器的影响。,优点,一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。优点,33,是纯度合乎要求的已知纯品化合物,是原样品中不含有的组分,内标物保留时间与待测组分相近,内标物的选择,是纯度合乎要求的已知纯品化合物内标物保留时间与待测组分相,34,和被分析的组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结,构、极性、挥发度以及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和相应特征，,最好是被分析物质的一个同系物。,完全溶于被测样品(或溶剂)中，且不与被测样品起化学反应,加入内标物的量和其响应值应接近于被测组分,内标物的选择, 和被分析的组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如,35,最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。,同位素标记的内标和待测物有相似的回收率、离子化,响应，和相似的色谱保留时间。,常见的做内标的类似物是氘代的化合物。,内标物的选择, 最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。 同位素标,36,做内标标准曲线时，内标物的浓度是固定不变的而待测物的浓度是呈梯度。,待测物的响应值(峰面积)与内标物的响应值的比也应该是呈梯度的(因为内标峰面积,理论上是不变的),这个比值叫做,RF。,内标标准曲线法,做内标标准曲线时，内标物的浓度是固定不变的而待测物的浓度是,37,利用RF,(而不是分析物的峰面积)对分析物的浓度所作的标准,曲线叫做内标标准曲线。,内标标准曲线法, 利用RF (而不是分析物的峰面积)对分析物的浓度所,38,曲线成立的必要条件:,A,内标物,的值是定值,为了使A,内标物,的数值是定值，需要所有测定试样中加入的内标物的量相同。,内标标准曲线法, 曲线成立的必要条件: A内标物的值是定值 为了使A,39,LC,-,MS,/,MS,酒类中氨基甲酸乙酯检测方法与技术, LC - MS / MS酒类中氨基甲酸乙酯检测方法与技,40,样品制备,样品制备,41,色谱柱：,XBridge,BEH,Amide,XP,Column,（,2.5,m,2.1,mm,150,mm,）；,柱温：,30,；,流速：,0.5,mL/min,；,进样量：,2L,；,流动相：,A,为,0.9%,甲酸水溶液，,B,为乙腈；,洗脱梯度：,0,1.3,min,，,95%,B,；,1.6,3.5,min,，,60,%,B,；,3.6,5,min,，,95%,B,色谱条件, 色谱柱：XBridge BEH Amide,42,%,%,%,%,Time,1.00,2.00,3.00,4.00,0,100,1.00,2.00,3.00,4.00,0,100,1.00,2.00,3.00,4.00,0,100,1.00,2.00,3.00,4.00,0,100,1.65,1.65,1.65,1.65,95.163,95.163,90.262.1,90.262.1,D,C,B,A,内标,EC-d5,标准,EC,样品,EC-d5,样品,EC,色谱图,%Time1.002.003.004.0001001.,43,电离方式：,APCI+,启用软电离模式；,扫描方式：多反应监测,(MRM),；,APCI,探针温度，,450,C,；,电晕针电压：,1kv,；,锥孔电压：,20,V,；,脱溶剂气流量：,950,L/h,；,锥孔气流量,:250,L/h,；,离子源温度：,150,质谱条件, 电离方式：APCI+启用软电离模式； 脱溶,44,目标物的多反应监测(MRM)参数,化合物,EC,EC-d5,母离子(m/z),90.2,95.1,子离子(m/z),62.1*,44.1,63*,锥孔电压(V),20,24,20,碰撞能量(eV),7,15,7,注:,*代表定量离子。,目标物的多反应监测(MRM)参数化合物母离子(m/z)子离子,45,酒类中氨基甲酸乙酯检测技术课件,46,LC,-,MS,/,MS,酒类中氨基甲酸乙酯分析质量控制, LC - MS / MS酒类中氨基甲酸乙酯分析质量控制,47,分析质量控制,AOAC.,(2012).,Guidelines,for,single,laboratory,validation,of,chemical,methods,for,dietary,supplements,and,botanicals.,AOAC,International,1-38.,AOAC,International,(2016).,Official,methods,of,analysis,Guidelines,for,standard,method,performance,requirements,(Appendix,F).,ICH,(2006).,ICH,topic,Q,2,(R1),validation,of,analytical,procedures:,Text,and,methodology.,London:,EMEA.,European,Commission,(2002).,Commission,Regulation,(EC),Implementing,Council,Directive,96/23/EC,concerning,the,performance,of,analytical,methods,and,the,interpretation,of,results,合格评定,化学分析方法确认和验证指南.中华人民共和国国家标准.,GB/T,27417-2017,分析质量控制 AOAC. (2012). Guide,48,检出限（LOD）和定量限(LOQ),当目标分析物的含量接近于“零”的情况下或者检测浓度接近检出限和定量限,时，需要确定方法的,LOD,或,LOQ,。,检出限,(LOD):,仪器检出限,(IDL),和分析方法检出限,(MDL),使用信噪比可用来考察仪器性能，但不适用于评估方法的检出限。,空白标准偏差法评估,LOD:,通过分析大量的样品空白或加入最低可接受浓度的样,品空白来确定,LOD,。独立测试的次数应不少于,10,次,检出限（LOD）和定量限(LOQ) 检出限(LOD):,49,真实浓度（g/kg）,范围,1g/kg,45*,10g/kg,32*,100g/kg,23,1000g/kg,16,在重现性条件下，对参考标准或加标样重复分析的实验室间变异系数（CV），,不得超出Horwitz方程计算的水平。该方程为：CV=2,E(1-0.5logC),在重复性条件下，实验室内CV通常在上述数值的一半到三份之二之间。在实,验室内重现性条件下进行的分析，其实验室内CV不应大于上述重现性CV。质量,分数低于100,g/kg时，用Horwitz方程给出无法接受的高值。因此，浓度低于,100,g/kg的CV应尽可能低.,定量方法的精密度(变异系数),真实浓度（g/kg）范围1g/kg45*10g/kg3,50,EC(g/kg),EC-Recovery(%),1,1.09,109,2,0.99,99,3,1.05,105,4,1.12,112,5,1.02,102,6,1.00,100,7,1.08,108,8,1.04,104,9,0.98,98,10,1.03,103,mean,1.04,104,RSD,0.0432,SD,0.0449,LOD,0.2,LOQ,0.6,酒中氨基甲酸乙酯LC-MS/MS方法验证,EC(g/kg)EC-Recovery(%)11.0910,51,定量方法的正确度,测量结果的正确度用于表述无穷多次重复性测定结果的平均值与参考值之间,的接近程度，正确度差意味着存在系统误差，通常用偏倚表示。而测量结果的,偏倚则通过回收试验进行评估。,定量方法的正确度 测量结果的正确度用于表述无穷多次重复性,52,定量方法的正确度,有证标准物质,(CRM),：与样品的基质匹配且浓度相近,分析参考物质,(RM),：将已知浓度的分析物加到样品中，按照预定的分析方法,进行检测，测得的实际浓度减去原先未添加分析物时样品的测定浓度，并除以,所添加浓度的百分率。,基质空白中加入一系列浓度的目标物所得回收率,定量方法的正确度 有证标准物质(CRM)：与样品的基质匹,53,真实浓度（g/kg）,范围,小于等于1,50%-120%,1-10,70%-110%,大于10,80%-110%,正确度：重复分析标准物质，测定的含量（经回收率校正后）平均值与真值,的偏差指导范围如下:,没有有证标准物质(CRM)时，可以通过测定空白基质中加入已知量分析物,的回收率获得。,正确度测定的规定,真实浓度（g/kg）范围小于等于150%-120%1-10,54,编号,测定值(g/kg),1,324,2,326,3,332,4,332,5,332,6,324,7,336,8,321,9,320,10,329,11,333,mean,328,CRMValue,334.1（274.9-393.3）,酒中氨基甲酸乙酯LC-MS/MS分析质控,编号测定值(g/kg)132423263332433253,55,感谢聆听,感谢聆听,56,