*,紫外可见分光光度法,UV-VIS,Ultraviolet-visible spectrophotometry,第,12,章,紫外可见分光光度法第12章,1,非光谱法,不以光的波长为特征讯号,例如,折射法，浊度法，旋光法,光谱法,光学分析法,基于物质光化学性质而建立起来的分析方法,在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、,吸收光,或散射光的波长和强度来进行分析的方法。,分为：,吸光光度法,，发射光谱法,非光谱法 不以光的波长为特征讯号光谱法光学分析法基于物质光,2,基于被测物质的分子,对光具有选择性吸收,的特性而建立起来的分析方法,叫,吸光光度法,.包括：,比色法,：,通过比较有色溶液颜色深浅,分光光度法：,根据物质对一定波长的光的吸收程度,真空紫外光度法：,10200,nm（,远紫外光）,紫外吸光光度法：,200,400,nm（,近紫外区）,可见吸光光度法：,400750,nm,红外光度法：2.5,1000 ,m,依据物质对不同波长范围光的吸收主要有：,基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方,3,特点,灵敏度高：,测定下限可达10,-5,10,-6,molL,-1, 10,-4,%10,-5,%,准确度,能够满足微量组分,(1%),的测定要求:,E,r,: 1%5%,操作,简便快速,应用广泛,特点,4,12.1 概述,12.2 光度分析方案的设计,12.3 吸光光度法应用简介,12.1 概述12.2 光度分析方案的设计 12.3 吸光光,5,12.1 概述,12.1.1,光的基本性质,12.1.2,物质对光的选择性吸收,12.1.3,光吸收的基本定律,12,.1.4,分光光度法及其仪器,12.1 概述12.1.1 光的基本性质12.1.2 物,6,波动性,粒子性,E,光的折射,光的衍射,光的偏振,光的干涉,光电效应,光的波粒二象性,光的基本性质,波动性粒子性 E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电,7,c,真空中光速 ：,3.0 10,8,m/s,波长：,1,m=10,-6,m, 1,n,m=10,-9,m, 1=10,-10,m,频率，单位：赫兹,Hz,次/秒,n,折射率，真空中为1：, =,c,；,波数 = 1/,=,/,c,光的传播速度:,波动性,c 真空中光速 ：3.0 108m/s光的传播,8,h,普朗克(,Planck,),常数,6.62610,-34,Js,频率,E,光量子具有的能量,单位：,J(,焦耳)，,eV(,电子伏特),1,eV=1.60210,19,J,微粒性,光是由光子流组成，光子的能量：,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34J,9,结论:,一定波长的光具有一定的能量，波长越,长(频率越低)，光量子的能量越低.,波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越波粒二象性,10,光谱区间,射线,x,射线,紫外光,红外光,微波,无线电波,10,-2,nm 10 nm 10,2,nm 10,4,nm 0.1 cm 10cm 10,3,cm 10,5,cm,可,见 光,400750,nm,0.1,nm,10,nm,750,nm0.1cm,0.1,mm1m,1m1000m,10,nm,200nm,200,400nm,远紫外,近紫外,（真空紫外）,光谱区间射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2 nm,11,单色光,复合光,单色光,复合光,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,白光,青蓝,青,绿,黄,橙,红,紫,蓝,互补色,单色光,复合光 单色光 复合光单一波长的光由不同波长的光组合,12,M +,热,M +,荧光或磷光,M +,h, M,*,基态 激发态,E,1,（,E,）,E,2,物质对光的吸收满足,Plank,条件,物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了,物质对光的选择吸收,基础。,M + 热M + 荧光或磷光M + h ,13,1.吸收光与透射光,当复合光照射到物体上时，一部分光被,吸收，而另一部分光则被透射过去。即：,入射光=吸收光透射光,吸收光,透射光,互补,1.吸收光与透射光当复合光照射到物体上时，一部分光被吸收,14,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,光的作用方式,表观现象示意,复合光,物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意光的作,15,/,nm,颜色,互补光,400-450,紫,黄绿,450-480,蓝,黄,480-490,绿蓝,橙,490-500,蓝绿,红,500-560,绿,红紫,560-580,黄绿,紫,580-610,黄,蓝,610-650,橙,绿蓝,650-760,红,蓝绿,不同颜色的可见光波长及其互补光,蓝,黄,紫红,绿,紫,黄绿,绿蓝,橙,红,蓝绿,/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄48,16,300,400,500,600,700,/,nm,545,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,Absorbance,MnO,4,-,的吸收光谱,300400500600700/nm 5451.00.,17,2.吸收光谱,(,Absorption Spectra,),S,2,S,1,S,0,A,h,分子内电子跃迁,带状光谱,用不同波长的单色光照射，测吸光度,吸收曲线,紫外可见,吸收光谱：分子价电子能级跃迁。,电子跃迁的同时，伴随着振动能级、转动能级的跃迁。带状光谱。,2.吸收光谱(Absorption Spectra)S2S1,18,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择性吸收,在一定实验条件下,A,c,A,c,增大,A,B,A,最大吸收波长,max,定性分析基础定量分析基础物质对光的选择性吸收在一定实验条件下,19,（1）,吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的,所决定，反映了分子内部能级分布状况-,定性分析基础,（2）,吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比-,定量分析基础,同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似,max,不变。在,max,处吸光度,A,随浓度变化的幅度最大。所以测定最灵敏。此特性可作为定量分析时选择入射光波长的重要依据。,Lambert-Beer,定律,吸收曲线的讨论：,（1）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的,20,1.透光率 (透射比,Transmittance ),透光率定义:,T,取值为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,入射光强度,I,0,透射光强度,I,t,一束平行单色光,1.透光率 (透射比,Transmittance )透光率,21,2.吸光度 (,Absorbance,),T,= 0.0 %,A,= ,T,= 100.0 %,A,= 0.0,溶液的,T,越大,说明对光的吸收越小,浓度低;,T,越小，溶液对光的吸收越大，浓度高,1.0,0.5,0,A,c,A,100,50,0,T,%,T,A,T,C,三,者,的,关,系,2.吸光度 (Absorbance)T = 0.0 %A =,22,吸光度的加合性,在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时体系总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。,吸光度的测量：,用参比溶液调,T,=100%（,A,=0），,再测样品溶液,的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，,溶剂、试剂对光的吸收等,。,吸光度的加合性在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时,23,3. 光吸收基本定律:,Lambert-Beer,定律,K,-,吸光系数,b,-,吸光液层的厚度(光程)，,cm,c,-,吸光物质的浓度，,g / L,mol / L,当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比,.,3. 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律K-吸,24,吸光度与光程的关系,A,=,K,b,c,0.10,b,0.20,2,b,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,朗,伯,定,律,(1760),吸光度与光程的关系 A = Kbc 0.10b0.202b0,25,吸光度与浓度的关系,A,=,Kb,c,0.10,c,0.20,2,c,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,比,尔,定,律,(1852),吸光度与浓度的关系 A = Kbc0.10c0.202c0.,26,K,K,a,吸光系数，,L,g,1,cm,-1,c,：,mol / L,c：g / L,c：g / 100 mL,K,比,吸光系数, 100,m,L,g,-1,cm,-1,吸光系数,(,K,),入射光波长,物质的性质,温度,与浓度无关,取值与浓度的单位相关,摩尔吸光系数，,L,mol,1,cm,-1,K K a吸光系数， L g 1,27,朗伯-比尔定律的适用条件,单色光,应选用,max,处或肩峰处测定.,稀溶液,浓度增大，分子之间作用增强.,吸光质点形式不变,离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等).,朗伯-比尔定律的适用条件单色光 稀溶液 浓度增,28,溶液浓度的测定,A,b c,工作曲线法,(校准曲线),朗伯-比尔定律的分析应用,0 1.0 2.0 3.0 4.0,c,(mg/mL),A,。 。 。 。,*,0.80,0.60,0.40,0.20,0.00,A,x,c,x,溶液浓度的测定A b c工作曲线法朗伯-比尔定律的分析应,29,偏离朗伯比耳定律的原因,标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。,引起这种偏离的因素（两大类）：,（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；,（2）化学性因素。,偏离朗伯比耳定律的原因 标准曲线,30,（1）,物理性因素,单色光不纯，导致负偏差。,散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿（,非平行入射光,）产生正偏差,为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器,此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。,（1）物理性因素 单色光不纯，导致负偏差。 散射,31,(2) 化学性因素,吸光质点的相互作用，,浓度较大时，产生负偏差，,朗伯-比尔定律只适合于稀溶液,（,C 10,5,超,高灵敏度,=(610）10,4,高灵敏, =,(,26)10,4,中等灵敏度;,105,34,定义：,当产生吸光度为,0.001,时，单位截面积(,1,cm,2,),的液层内所能检测出的吸光物质的最低含量。,用,S,表示，单位,：,g,cm,-2,S,小,灵敏度高;,相同的物质,M,小则灵敏度高.,Sandell(,桑德尔)灵敏度,(,S,),定义：当产生吸光度为0.001时，单位截面积(1cm2)的液,35,A,=,bc,=,0.001,bc,0.001/,变换单位:,b,cm,c,mol/L=,bc,M,10,6,g/1000cm,2,A= bc=0.001 bc,36,例1 邻二氮菲光度法测铁 :,(,Fe)=1.0mg/L,b,=2cm ,A,=0.38 ,计算, ，,S,和,解：,c,(Fe)=1.0 mg/L=1.010,-3,g/L,/55.85g/mol,=1.810,-5,mol/L,S,=,M,/,=,55.85/1.110,4,=0.,0051 (,g,/cm,2,),例1 邻二氮菲光度法测铁 :(Fe)=1.0mg/L,37,c,=1.0mg/L=1.010,-3,g /1000mL,= 1.010,-4,g/100mL,c =1.0mg/L=1.010-3 g /,38,分光光度法,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.,波长可调, 故选择性好, 准确度高.,光源,单色器,检测系统,吸收池,分光光度法 通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.光源单色器,39,仪器,可见分光光度计,仪器 可见分光光度计,40,仪器,紫外-可见分光光度计,仪器 紫外-可见分光光度计,41,光源,：,发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。,可见光区：,钨灯，碘钨灯,(3202500,nm),紫外区：,氢灯，氘灯,(180375,nm),氙灯,：,紫外、可见光区,均可用作光源,/,nm,钨灯（,热辐射光源,）,400,600,800,1000,氙灯（,气体放电光源,）,氢灯,强度,一、分光光度计的主要部件,光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定,42,氙灯,氢灯,钨灯,氙灯氢灯钨灯,43,单色器,：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。,棱镜,:,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,入射狭缝,准直透镜,棱镜,聚焦透镜,出射狭缝,白光,红,紫,1,2,800,600,500,400,单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。棱镜,44,光栅：,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的,等宽度等间距,条痕(600、1200、2400条/,mm )。,M,1,M,2,出射狭缝,光屏,透镜,平面透射光栅,光栅衍射示意图,原理,：,利用光通过光栅时,发生衍射和干涉现象而分光.,波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600,45,吸收池,(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。,可见光区：光学玻璃池（,3503200,nm）,紫外区：石英池,玻璃,（,1854000,nm）,检流计,（指示器）：,低档仪器：刻度显示,中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,检测器,：利用光电效应，将光能转换成,电流讯号。,光电池，光电管，光电倍增管,吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。检流计（指示器）：检,46,吸光光度法仪器主要差异比较,可见光,(400,750,nm),紫外光,(200,400,nm),光源,钨灯,碘钨灯,3202500,氢灯,氘灯,180375,吸收池,材料,玻璃,（3503200）,石英,（,1854000,）,吸光光度法仪器主要差异比较可见光紫外光光源钨灯氢灯吸收池玻璃,47,二、分光光度计的类型,1. 单光束分光光度计,2. 双光束分光光度计,多通道仪器,同时测量200820,nm,范围内的整个光谱, 比单个检测器快316倍,信噪比增加316,1/2,倍.,3. 其他类型分光光度计,纤维光度计,将光度计放入样品中,原位测量.,对环境和过程监测非常重要.,二、分光光度计的类型1. 单光束分光光度计2. 双光束分光光,48,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,单波长单光束分光光度计,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，,一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有,很高的稳定性。,0.575光源单色器吸收池检测器显示单波长单光束分光光度计简,49,单波长双光束分光光度计,比值,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,光束分裂器,自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵 敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂， 价格较高。,单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂,50,2,2,51,12.2 光度分析方案的设计,12.2.1,显色反应及其条件的选择,12.2.2,光度测量条件的选择,12.2.3,标准曲线、线性方程及方法评价,12,.2.4,建立光度分析方法的一般步骤,12.2 光度分析方案的设计12.2.1 显色反应及其条件,52,一. 显色反应,mX,(,待测物),nR,(,显色剂),X,m,R,n,(,有色化合物),主要有,配位反应(为主),和,氧化还原反应,。,一. 显色反应mX(待测物)nR(显色剂)XmRn(有,53,配位显色反应,当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。,氧化还原显色反应,例如：钢中微量锰的测定，,Mn,2,不能直接进行光度测定,2,Mn,2,5 S,2,O,8,2-,8 H,2,O =2 MnO,4,-,+ 10 SO,4,2-, 16H,+,将,Mn,2,氧化成紫红色的,MnO,4,-,后,，,在525,nm,处进行测定。,配位显色反应氧化还原显色反应例如：钢中微量锰的测定，Mn2,54,二. 显色剂,：,：,：,：,助色团：,NH，OH，X,(,孤对电子),n,e,O,生色团,：,NN，NO，,O,C=S,N （,共轭双键）,e,无机显色剂:,SCN,-,Fe(SCN),2+,H,2,O,2,TiOH,2,O,2,2+,有机显色剂:,二. 显色剂 ：助色团：NH，OH，X (孤,55,CH,3,CCCH,3,HON NOH,N,N,OH,COOH,SO,3,H,OO,型：,N,N,N,O,H,OH,ON,型,：,PAR,N,H,N,H,N,S,N,S,型,：,双硫腙,NN,型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,有机显色剂,CH3CCCH3NNOHCOOHSO3HOO型：N,56,三.显色反应的选择,*,灵敏度高,，一般,10,4,*,选择性好,*显色剂在测定波长处无明显吸收。,对照性好,max,60 nm .,*,反应生成的有色化合物,组成恒定,，稳定,。,*显色条件易于控制，,重现性好,。,三.显色反应的选择*灵敏度高，一般104,57,要求有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。,R,A,MR,R,MR,要求有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。RAMR,58,Fe,3+,+,磺基水杨酸, 三磺基水杨酸铁(黄色),（组成固定）,Fe,3+,+ SCN,-, FeSCN,2+,、 Fe(SCN),2,+,（,组成不固定）,Fe3+ + 磺基水杨酸 三磺基水杨酸铁(,59,四. 显色条件的确定,c,(R),c,(R),c,(R),1. 显色剂用量,Mo(SCN),3,2+,浅红,Mo(SCN),5,橙红,Mo(SCN),6,-,浅红,Fe(SCN),n,3-,n,选择曲线变化平坦处。,四. 显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1. 显色剂用,60,2. 显色反应酸度,OH,-,酸度的影响,副反应,M + nR = MRn,H,+,存在型体的变化,RH = R,-,+ H,+,生成不同配比的络合物,例，磺基水杨酸(,ssal) Fe,3+,pH = 2 3,FeR,紫红色,pH = 4 7,FeR,2,橙色,pH = 8 10,FeR,3,黄色,pH12,Fe(OH),3,沉淀,2. 显色反应酸度 OH-酸度的影响副反应M + nR,61,pH,1,pHpH,2,选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区,A,pH,pH1pH,Cs,）,A,x,适宜,高,浓度的测定,A,C,C,x,A,x,差示工作曲线,标准溶液,c,s,、,c,1,、,c,2,、,c,3,。以,c,s,作参比，调,A = 0.,测,c,1,、,c,2,、,c,3,的,A,，用,A,对,c,作图,.,同条件下测,A,x,.,从差示工作曲线中查出,c,x,.,示差法以浓度为 Cs 的标准溶液为参比（Cx Cs）,84,示差法提高准确度的实质,常规法,T,x,T,0,5,10,50,100,落在测量误差较,大,的范围,示差法,T,0,5,10,50,100,T,r,T,s,T,s,落在测量误差较,小,的范围,结论：,示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度,标尺扩展10倍,示差法提高准确度的实质常规法TxT051050100 落在测,85,络合物组成的测定,(1),摩尔比法,(,饱和法,),固定,c,M,改变,c,R,从,0,开始增大,M + nR = MRn,C,MRn,C,R,络合物组成的测定(1)摩尔比法(饱和法)M + nR,86,在特定波长测定,R,= 0,M,= 0,MRn,0,R, 0,M, 0,MRn,=0,C,R,/C,M,A,A,C,R,/C,M,n,A,C,R,/C,M,n,在特定波长测定R = 0,M = 0,MRn 0R,87,(2),等摩尔连续变化法,（,Job,）,:,C,M,/ C,从,0 1,R,= 0,M,= 0,MRn,0,R, 0,M, 0,MRn,=0,0,0.5,1.0,A,C,M,/,C,0.33,n = 1,C,M,/,C,=0.5,n = 2,C,M,/,C,=0.33,0,0.5,1.0,A,C,M,/,C,(2)等摩尔连续变化法（Job） :CM / C 从 0 ,88,目视比色法,标准系列,未知样品,特点,利用自然光,比较吸收光的互补色光,准确度低,(,半定量,),不可分辨多组分,方法简便，灵敏度高,目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光,89,1.,了解分子对光的吸收,.,吸收曲线,定性分析的基础。,2.,掌握光吸收基本定律,:,朗伯,-,比尔定律,定量分析的基础,A=,K,bc,=-lg,T,式中各参数的物理意义，定量计算。,3.,分光光度计基本部件,;,4.,灵敏度的表示,、,S,5.,显色反应及条件的确定,:,显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。,6.,吸光测量条件的选择：波长、浓度、参比的选择,7.,应用及,方法,:,单一组分测定示例、多组分测定、高浓度组分测定、络合物组成的测定,.,本,章要求,1.了解分子对光的吸收. 吸收曲线定性分析的基础。本章要求,90,1.,取钢样,1.00g,，溶解，将其中锰氧化成高锰酸盐，准确配制成,250mL,，测得其,A,为,1.00,10,-3,mol,L,-1,KMnO,4,溶液,A,的,1.5,倍。计算钢样中锰的百分含量。（锰的原子量为,54.94,）,2.,含铁约,0.2%,的试样，用邻二氮菲光度法（,=1.1,10,4,）测定。试样溶解后稀释至,100mL,，用,1.00cm,比色皿，在,508nm,波长下测定,A,。,a,）为使,A,测量引起的浓度相对误差最小，应当称取试样多少克？,b,）如果所用光度计吸光度最适宜范围为,0.200,至,0.650,，测定时应控制含铁的浓度范围为？（铁的原子量为,55.85,）,紫外可见分光光度法ppt课件,91,