单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,内 容 提 要,一,.,内毒素（,LPS,）的检测,二,.,肠道致病菌的分离培养,三,.,细菌的分布与消毒灭菌,家兔发,热,法,烦琐、灵敏度不高,鲎试验法,操作简便、灵敏度高，可检测小于,10ng,/,ml,的内毒素。,一、内毒素（,LPS,）的检测（,1.5,学时）,区别要点,外毒素,内毒素,来源,G+,菌,及部分,G-,菌,G-,菌,存在部分,活菌分泌,少数为菌体崩解,为细胞壁成分,菌体崩解,化学成分,蛋白质,脂多糖,稳定性,60-80,30min,被破坏,160,2-4h,被破坏,毒性,强,有选择性,引起特殊表现,较弱,毒性效应大致相同,抗原性,强,可刺激机体产生抗毒素,可被制成类毒素,甲醛处理不形成类毒素,目 的,掌握内毒素检测的方法及临床意义。,临床意义,1.,检测输液用品或生物制品中是否含有 内毒素。,2.,检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症（内毒素休克）等。,材 料,鲎试剂,鲎试剂溶解水,内毒素试剂,无菌注射器,方法及结果,方法：,1.,取,两支鲎试剂,打开，分别加入,0.1ml,鲎试剂溶解水,，,振摇使之完全溶解。,2.,其中一支加入,0.1ml,内毒素，,标记为实验组，,另一支加入,0.1ml,溶解水，,标记为对照组。,3.,垂直放入,37,温箱，,20-30,分钟,观察结果。,结果：,实验组出现凝固,，,对照组不出现凝固,二,.,肠道致病菌的分离培养（,1.5,学时）,粪 便增菌培养（必要时）,SS,培养基,革兰染色,双糖铁培养基,生化反应,血清学鉴定,肠道杆菌的鉴定程序,1,、材料,粪便,、,ss,平板,接种环和酒精灯等。,粪便中病原菌的分离,一,.,致病性肠道杆菌的生物学性状,二,.,常见培养基的特性及用途,三,.,分离培养方法,内 容 提 要,大肠杆菌,:,生物学性状,:G-,镜下为杆状,营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长,最适宜温度为,37,度,最适宜,pH,为,7.4,肠道杆菌的生物学性状,菌落特点：,圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径,2-3mm,。,菌落特点,:,圆形,凸起,无色透明,中等大小。,1,、相似的形态染色,从形态上无法区别,中等大小的,G,-,杆菌,多有鞭毛、菌毛,肠道杆菌的生物学性状,2,、活泼的生化反应,肠道杆菌的生物学性状,乳糖发酵试验,初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌,肠道致病菌,肠道非致病菌,多数不发酵乳糖,多数发酵乳糖,肠道杆菌的生物学性状,-/+,-,+,伤寒杆菌,-,-,+,痢疾杆菌,-,大肠杆菌,硫化氢,乳糖,葡萄糖,菌名,2,、活泼的生化反应,一,.,常见肠道杆菌的生物学性状,二,.,常见培养基的特性及用途,三,.,分离培养方法,二、肠道致病菌的分离培养,SS,平板,大肠杆菌,粉红色,大菌落,痢疾杆菌 无色细小 半透明菌落,伤寒杆菌 无色细小 半透明菌落,常见培养基的特性,双糖铁培养基上各菌的生长特点,含有乳糖和葡萄糖：产酸产气,含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成,硫化氢，可形成黑色沉淀,酚红指示剂：,酸：黄,碱：红,1),大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。,2),沙门菌和志贺菌,只发酵葡萄糖，不发酵乳糖,，分解葡萄糖产的酸使培养基,pH,下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有,0.1%,，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，而底层则为黄色。,将粪便标本以分区划线法接种到,SS,培养基。,(,每个实验室,8,个平板）,(,接种好后，做好标记，用胶布按班绑好,),放入,37,温箱中培养,24,小时。取出放,4,冰 箱,中保存备用。,分离培养方法,三、消毒灭菌及细菌的分布,（,2,学时）,1.,高压蒸汽灭菌法,2.,细菌在自然界的分布及理化因素,对细菌的影响,2.,咽喉部细菌的检查（每班,2,个平皿）,取血琼脂平板,1,块，打开平皿盖，将培养基面置于口腔前,10cm,处，受试者用力咳嗽几次；,盖上平皿盖，置,37,温箱中倒置培养,24h,后取出观察结果,。,细菌在自然界的分布,体表细菌的检查,方法,：,取一普通平皿培养基，,一部分写上,“,前,”,，另一部分,写上,“,后,”,，然后将手指在写,有,“,前,”,的部分沾一下，再将,手指用酒精进行消毒，在写,有,“,后,”,的部分沾一下。放入,37,温箱培养,24,小时,后观察。,（,每个实验室,4,个平皿,）,高压蒸汽灭菌法,注意事项：,锅内物品不宜过紧。,注意排出冷气，否则气压表虽已达,15,磅，温度,达不到,121.3,，,不能保证灭菌效果。,灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或,引起破裂。,不耐高热高压之物品，不能用此法。,紫外线杀菌作用,强,，而穿透能力,弱,。,紫外线中波长为,200-300nm,者具有杀菌能力，其中,265-266nm,的杀菌作用最强。,杀菌机制：引起,DNA,链上相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而干扰,DNA,的复制和转录，导致细菌死亡。,紫外线对细菌的影响,紫外线对细菌的影响（,每个实验室,1,个培养皿）,取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，打开一半平皿盖，置于紫外灯下照射,30,分钟，然后盖好平皿，置,37,培养,24h,后取出观察结果。,密涂接种,分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转,60,度二次密涂接种，然后同方向旋转,60,度后再次密涂接种。,有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，,称为化学消毒剂；,浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂；,只能外用，对细菌的敏感性不同。,化学消毒剂对细菌的影响,化学消毒剂对细菌的影响,方法,：,取一普通平皿培养基，,一部分写上,“,前,”,，另一部分,写上,“,后,”,，然后将手指在写,有,“,前,”,的部分沾一下，再将,手指用酒精进行消毒，在写,有,“,后,”,的部分沾一下。放入,37,温箱培养,24,小时,后观察。,（,每个实验室,4,个平皿,）,实验二通课,鲎试验（两人一支）,肠道致病菌分离培养,S-S,培养基,8,个,/,室,为避免分离不到细菌，每个实验室用,4,个,S-S,培养基接种大肠杆菌，另外,4,个接种粪便。,细菌的分布与消毒灭菌,1.,空气、咽喉部、手指、紫外线,(,其中血平板,2,个,/,室，普通平板,6,个,/,室,),空气,1,个、咽喉,2,个、紫外线,1,或,2,个、手指,3,或,4,个,手指消毒：肥皂洗手、碘酒、酒精,2.,高压蒸气灭菌法（两个实验室一台高压锅）,第二天观察结果,本次试验不写试验报告，下周一起写肠道杆菌的分离鉴定依据和结果,预习下周内容：肠道杆菌的鉴定、药敏实验,