,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一、实验目,的,1,、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原理及步骤。,2,、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。,3,、巩固显微镜油镜的使用技术。,实验二,细菌的简单染色法和革兰氏染色法,二、实验原,理,1,、细菌的简单染色原理,细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。,在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料的染色部分带负电荷），因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。,2,、细菌革兰氏染色的原理,G,+,菌和,G,-,菌的细胞壁结构和组成有较大的区别,。,G,+,菌,细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，结晶紫,-,碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保留初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫色。,G,-,菌,细胞壁的,外膜层,富含类脂,，,而且其,肽聚糖,层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙，使得,菌体内的结晶紫,-,碘复合物较易,渗出,，,而使菌体变成无色,，,再经番红,复染,就,成为红色。,三、实验器材,1,、菌种：,革兰氏染色：培养,12 h,16 h,的枯草芽孢杆菌,120,和培养,24 h,的大肠杆菌。,2,、染色液和试剂：,结晶紫、碘液、,95%,酒精、沙黄或蕃红,3,、器材：,载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,菌龄对革兰氏染色结果的影响：选取处于活跃生长期,指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌体尚未成熟或菌体过老，可能使染色结果呈现相反的结果。,（,一）简单染色的步,骤（,见,P11,）,1,、,涂片,：,取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；,在,载玻片中央滴,一小滴,生理盐水，,用接种环以无菌操作取少许,菌体,于水滴中,（,注：不要挑破培养基,）,，,混匀并涂成薄膜,（,注：涂片不易过厚,）,。,2,、,干燥,：用夹子夹住载玻片一端（,菌膜面,朝上,）,，,反复,通过,火焰,高处,数次，,烘干菌液（,注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形,）。,3,、,固定,：,用夹子夹住载玻片一端，迅速通过火焰,2,3,次，,使菌体固定于载玻片上。,4,、,染色,：将玻片平放于玻片架上，加适量（,以盖满菌膜为度,）染液于涂片上。,染色时间,1-2min,。,5,、,水洗,：倒去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗,（切勿将菌膜冲掉）,，,直至流下的水为无色为止。,6,、,干燥,：将玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。,7,、,镜检,：先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察。,四、实验步骤,（二）革兰氏染,色（,见,P12,),1,、涂片、固定,（,1,）,涂片,“三区”涂片法。,在载玻片的左端先加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合；将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在载玻片的右端加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合；将玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。（,三区：左区,苏云金芽孢杆菌区；中央区,两种菌的混合区；右区,大肠杆菌区,）。,（,2,）,干燥及固定。,步骤同简单染色法。,涂片不易过厚，否则造成局部菌体脱色不完全，而使,G,-,菌呈现革兰氏阳性结果。,2,、染色,（,1,）初染。,将玻片置于玻片架上，加适量（以覆盖菌膜为度）结晶紫染液染色,1,2 min,；倾去染液，,用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水为无色。,（,2,）媒染。,加卢戈氏碘液一滴，染色,1 min,，水洗。,（,3,）脱色。,将玻片倾斜，连续滴加,95%,乙醇脱色,20,25s,至流出液无色，立即水洗。,（,4,）复染。,滴加蕃红复染,2min,后，立即水洗至流出液无色。,（,5,）干燥及镜检。,将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。,先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察,，并判断菌体的革兰氏染色反应性。,脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，,G,-,菌转呈革兰氏阳性结果；如果脱色时间过长，,G,+,菌转呈革兰氏阴性结果。,媒染时间对革兰氏染色结果的影响：媒染时间过短，不利于结晶紫与细胞之间的结合，而使,G,+,菌转呈革兰氏阴性结果,;,媒染时间过长，而使,G,-,菌转呈革兰氏阳性结果。,结晶紫,碘 液,95%,乙醇,番 红,初 染,1,2,min,媒 染,1min,脱色,20,25s,复 染,2min,绘出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。,（五）作业,大肠杆菌（,10,100,）,枯草,芽孢杆菌,120,（,10,100,）,大肠杆菌,_,色，革兰氏,_,性菌；,枯草芽孢,杆菌,120_,色，革兰氏,_,性菌,。,（六）思考与讨论,1,、造成革兰氏染色结果不正确（假阳性或假阴性）的主要原因有哪些？,2,、如果某一细菌的革兰氏染色结果为红色，能否确定该菌就是革兰氏阴性菌？,下次实验题目：,放线菌及蓝细菌的形态观察,酵母菌的形态观察及大小测定,