,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,南华大学 生物化学第,14,章基因重组与基因工程,第一节 自然界的,DNA,重组,自然界中，不同物种或个体之间经常发生,DNA,重组和基因转移，它是,基因变异,、,物种演变,和,生物进化,的基础。,转 座 重组,(transpositional recombination),位点特异的重组,(site-specific recombination),同源重组,(homologous recombination),基因重组的分类：,发生在同源序列之间的重组称为同源重组，它通过链的断裂和再连接，在两个,DNA,分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。是最基本的,DNA,重组方式，因此又称,基本重组,。,一、同源重组是最基本的,DNA,重组方式,以,E.coli,的同源重组为例，了解同源重组机制的,Holliday,模型,(1964,年由,Holliday R,提出,),。,同源重组不需要特异的,DNA,序列,而是依赖于两分子之间序列的相似性,.,两个同源染色体,DNA,排列整齐。,一个,DNA,的一条链断裂、并与另一个,DNA,对应的链连接，形成,Holliday,中间体。,通过分支移动产生异源双链,DNA,。,Holliday,中间体切开并修复，形成两个双链重组体,DNA,。,Holliday,模型中，同源重组主要有,4,个关键步骤：,内切酶,(recBCD),DNA,侵扰,(recA),分支迁移,(recA),内切酶,(recBCD),5,3,5,3,5,3,5,3,两个同源染色体,DNA,排列整齐,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,一个,DNA,的一条链断裂、并与另一个,DNA,对应的链连接，形成,Holliday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,通过分支移动产生异源双链,DNA,3,5,5,3,5,3,5,3,DNA,连接酶,5,3,3,3,5,3,5,3,Holiday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,Holiday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,5,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,片段重组体,拼接重组体,DNA,连接酶,内切酶,(RuvC),DNA,连接酶,内切酶,(RuvC),Holliday,中间体切开并修复，形成两个双链重组体,DNA,片段重组体：,切开的链与原来断裂的是同一条链,，重组体含有一段异源双链区，其,两侧来自同一亲本,DNA,。,拼接重组体：,切开的链并非原来断裂的链,，重组体异源双链区的,两侧来自不同亲本,DNA,。,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,二、细菌的基因转移与重组有四种方式,（一）接合作用,(conjugation),当细胞与细胞、或细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒,DNA,从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的,DNA,转移称为接合作用。,接合作用,(conjugation),转化作用,(transformation),转导作用,(transduction),细胞融合,(cell fusion),可接合质粒如,F,因子,(,细菌性鞭毛蛋白编码基因,),质粒,细菌染色体外的小型环状双链,DNA,分子,.,（二）转化作用,(transformation),通过自动获取或人为地供给外源,DNA,，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。,例：溶菌时，裂解的,DNA,片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的,DNA,转移及基因重组即为转导作用。,即通过噬菌体将细菌基因从供体细胞转移到受体细胞的过程,.,噬菌体的生活史,溶菌生长途径,(lysis pathway),溶源菌生长途径,(lysogenic pathway),例：,例：,噬菌体感染宿主伴随基因转移,在有些细菌的种属中可发生,由细胞质膜融合,导致的基因转移和重组。,在实验条件下，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖而成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的,DNA,发生广泛的重组。,（四）细胞融合,定义：由,整合酶催化,，在两个,DNA,序列的特异位点之间,发生的整合。,噬菌体的,整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒,cDNA,的长末端重复序列,(long terminal repeat, LTR),。,三、位点特异重组,(site-specific recombination),例 ：（一）,噬菌体,DNA,的整合,例（二）细菌的特异位点重组,鼠伤寒沙门氏菌,H,片段倒位决定鞭毛相转变,H2,鞭毛素,阻遏蛋白,Hin,重组酶,转位片段,hin,H2,I,H1,H1,鞭毛素,hin,H2,I,DNA,启动序列,H1,启动序列,沙门氏菌,H,片段倒位决定鞭毛相转变,例（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白,(Ig),，由两条轻链,(L,链,),和两条重链,(H,链,),组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链,(,和,),，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,L V J C,L V D J C,重链,(IgH),基因的,V-D-J,重排和轻链,(IgL),基因的,V-J,重排均发生在特异位点上。在,V,片段的下游，,J,片段的上游以及,D,片段的两侧均存在保守的,重组信号序列,(recombination signal sequence, RSS),。此重排的重组酶基因,rag,(recombination activating gene),共有两个，分别产生蛋白质,RAG1,和,RAG2,。,CACAGTG,(12/23),ACAAAAACC,GTGTCCAC TGTTTTTGG,重组信号序列,基因片段,V,片段,J,片段,RSS,RSS,间插,DNA,OH,OH,V,J,单链切开,RAG1,RAG2,分子内转酯反应,单链切开,转移核苷酸,修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,四、转座重组,（,transpositional recombination,）,由,插入序列,和,转座子,介导的基因移位或重排称为,转座,(,transposition,),。,（一）插入序列转座,（二）转座子转座,插入序列,(,insertion sequence, IS,),的组成：,二个分离的反向重复,(inverted repeats, IR),序列,;,一个转座酶（,transposase),编码基因,.,IR,Transposase Gene,IR,发生形式：,保守性转座,复制性转座,（一）插入序列转座,插入序列的复制性转座,转座子,(transposons) ,可从一个染色体位点转移到另一位点分散的重复序列。,转座子组成：,两个反向重复序列（,分布在转座酶及其它抗性基因的两侧,）；,转座酶编码基因；,抗生素抗性等有用的基因。,IR,IR,Transposase Gene,有用基因,（二）转座子转座,转座子与插入序列的相同点,:,都含两个反向重复序列及转座酶基因。区别,:,转座子含有抗生素抗性等有用的编码基因,.,由转座子介导的转座,重组,DNA,技术的发展史：,年,GJ Mendel,的豌豆杂交试验,.,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,.,1967,年 世界上,5,个实验室发现了,DNA,连接酶,.,1970,年,Smith,在微生物中发现限制性内切酶。,Temin,和,Baltimore,发现逆转录酶。,1973,年 美国,Paul Berg,和,DA Jackson,构建第一个重组,DNA,分子,.,1977,年 美国建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物。,1981,年 转基因小鼠问世。,1982,年 应用重组,DNA,技术生产的胰岛素经美国,FDA,批准上市。,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,.,第二节 重组,DNA,技术,一、重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即无性繁殖。,克隆可以在,DNA,分子水平、细胞水平、植物或动物整体水平进行。,（一）,DNA,克隆,不同来源的,DNA,可以是：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的,DNA,。,DNA,克隆（,DNA cloning,）：,应用酶学的方法，在体外将各种来源的,DNA,与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,生物技术工程,:,基因工程、蛋白质工程、,酶工程、细胞工程等,基因工程的应用,:,分离获得某一感兴趣的基因, 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组,DNA,技术、重组,DNA,工艺学。,（二）重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,定义,:,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease, RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属 系 株 序,Haemophilus,in,fluenzae d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,分类,:,、,、,（基因工程技术中常用,型）,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口 ：平端切口,、,粘端切口,GGATCC,CCTAGG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶,:,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,1967,年世界上,5,个实验室同时发现了,DNA,连接酶,。,T4 DNA,连接酶催化双链,DNA,一端,3-OH,与另一双链,DNA,的,5,端磷酸根形成,3-5,磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平端的,DNA,两端连接起来。,需要,ATP,和,Mg,2+,存在。,DNA,连接酶,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,:,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,。,cDNA (complementary DNA),是指经反转录合成、与,RNA,链（通常指,mRNA,或病毒,RNA,）互补的,单链,DNA,（即,complementary DNA,之缩写）。,在合成单链,cDNA,后，以单链,cDNA,为模板，由依赖,DNA,的,DNA,聚合酶合成双链,cDNA,。,基因组,DNA (genomic DNA),指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有,DNA,序列。,（三）目的基因（又称外源基因）,（四）基因载体,定义,:,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录、翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,基因载体可分为：,载体的选择标准,能自主复制；,具有遗传标记基因，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,。,常用载体：质粒,DNA,、噬菌体,DNA,、病毒,DNA,。,1.,质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,2.,噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列、,pUC,系列,3.,粘性质粒,(cosmid),酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome, YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome, BAC),动物病毒,DNA,改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,二、重组,DNA,技术基本原理基操作步骤,基本步骤,目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,重组,DNA,导入受体菌,重组体的筛选,克隆基因的表达,（一）目的基因的获取,1.,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,2.,基因组,DNA,文库,3. cDNA,文库,4.,聚合酶链式反应（,PCR,）,*,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,组织或细胞染色体,DNA,基因片断,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,构成基因组,DNA,文库,限制性内切酶,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,*,从基因组,DNA,文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,*,从,cDNA,文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,（三）外源基因与载体的连接,粘性末端连接,平头末端连接,同聚物加尾连接,人工接头连接,（二）克隆载体的选择和构建,质粒一般只能容纳,小于,10 kb,的外源,DNA,片段，主要用作,亚克隆载体,。一般说来，外源,DNA,片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低；噬菌体能插入的外源,DNA,大小为,9,23 kb,。可用于构件基因组文库。,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,2.,平端连接,适用于：限制性内切酶切割产生的平端；粘端补齐或切平形成的平端。,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,宿主细胞类型：原核细胞、真核细胞。,宿主细胞条,件：,安全宿主菌；,限制酶和重组酶缺陷；,处于感受态,(competent),。,导入方式：,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,导入宿主细胞,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择（,Ap,、,Tetr,、,Kan,）。,(2),标志补救（ 如,互补）。,(3),分子杂交法（原位杂交、,Southern,印迹）,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等。,（五）重组体的筛选,(,插入失活法,),抗药性标记选择,互补的检测,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,（六）克隆基因的表达,表达体系分为：原核表达体系、真核表达体系。,原核表达体系：大肠杆菌（工程菌）。,优点：培养简单，迅速、经济、适合大规模生产。,缺点：表达的蛋白质为不溶性的包涵体。需复性与折叠。,真核表达体系：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。,优点：表达的蛋白被正确折叠、修饰加工。,缺点：操作技术难、费时、费钱。,