单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 原位杂交组织化学,原位杂交组,织,织化学（ISHH）,原理：,用标记的DNA或RNA为探针，,在,在原位检测,组,组织细胞内,特,特定核酸,序列的方法,。,。,特点：杂交在载玻,片,片上的细胞,进,进行。,分类：,根据所用探,针,针和靶核苷,酸,酸不同-,DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交,、,、RNA-RNA杂,交,交,根据探针标,记,记物是否直,接,接被检测,直接法、间,接,接法,一 原位杂,交,交的由来与,发,发展,（一）核酸,分,分子杂交技,术,术,按其作用方,式,式大致分为,液,液相杂交和,固,固相杂交两,种,种,液相杂交：参加反应的,两,两条核酸链,都,都游离在溶,液,液中。,液相分子杂,交,交技术包括,：,：,吸附杂,交,交,发光液,相,相杂交,液相夹,心,心杂交,复性速,率,率液相分子,杂,杂交,固相杂交：,是将参加反,应,应的一条核,酸,酸链固定在,固,固体的支持,物,物上常用的,有,有硝酸纤维,素,素滤膜，其,它,它如尼龙膜,、,、乳胶颗粒,和,和微孔板等,）,），另一条,参,参加反应的,核,核酸链游离,在,在溶液中。,固相杂交技术包,括,括：,菌落原位杂,交,交,斑点杂交法,Southern印迹杂交,Northern印迹杂交,组织原位杂,交,交,（二）原位杂交,技,技术的发展,在近20年飞跃,发,发展的突出特点,：,：,由分子遗传,学,学研究提供的探,针,针大量增加；,探针生产的,可,可靠性和速率大,大,大发展了；,非,非放,射,射性,标,标记,物,物的,发,发展,使,使原,位,位杂,交,交技,术,术成,为,为实,验,验室,的,的常,规,规技,术,术和,临,临床,日,日常,应,应用,的,的诊,断,断技,术,术。,新,新的,非,非放,射,射性,标,标记,技,技术,正,正在,继,继续,不,不断,涌,涌现,。,。,二,原,原位,杂,杂交,组,组织,化,化学,基,基本,技,技术,原位,杂,杂交,的,的基,本,本方,法,法和,应,应用,原,原则,：,：,杂,杂交,前,前准,备,备，,包,包括,固,固定,、,、取,材,材、,玻,玻片,和,和组,织,织的,处,处理,，,，如,何,何增,强,强核,酸,酸探,针,针的,穿,穿透,性,性、,减,减低,背,背景,染,染色,等,等；,杂,杂交,；,；,杂,杂交,后,后处,理,理；,显,显示,（,（visualization,）,）：,放射,性,性自,显,显影,显,显色,、,、非,放,放射,性,性标,记,记显,色,色,（一,）,）原,位,位杂,交,交的,基,基本,要,要求,1,固,固定,2,玻,玻片,和,和组,织,织切,片,片的,处,处理,3,杂,杂交,4,杂,杂交,后,后处,理,理,5,显,显示,6,对,对照,实,实验,和,和ISHH结,果,果的,判,判断,1,固,固定,固定,剂,剂的,应,应用,和,和选,择,择原,则,则：,保,保持,细,细胞,结,结构,；,；,最,最大,限,限度,地,地保,持,持细,胞,胞内DNA或RNA水,平,平；,使,使探,针,针易,于,于进,入,入细,胞,胞或,组,组织,。,。,DNA：比较,稳,稳定,，,，对,于,于DNA,的,的定,位,位来,说,说，,固,固定,剂,剂的,种,种类,和,和浓,度,度并,不,不十,分,分重,要,要。,RNA：易被,降,降解,，,，在RNA的,定,定位,上,上，,要,要使RNA的,降,降解,减,减少,到,到最,低,低限,度,度，,固,固定,剂,剂的,种,种类,、,、浓,度,度和,固,固定,的,的时,间,间十,分,分重,要,要，,而,而且,取,取材,后,后应,尽,尽快,予,予以,冷,冷冻,或,或固,定,定。,固定,剂,剂：,多聚,甲,甲醛,、,、醋,酸,酸-,酒,酒精,混,混合,液,液、Bouins固,定,定剂,、,、Carnoy,s,液,液,优缺,点,点：,沉淀,性,性固,定,定剂,：,：酒精/醋,酸,酸混,合,合液,、,、Bouin,s,液,液、Carnoys液,能增,加,加核,酸,酸探,针,针的,穿,穿透,性,性，,但,但不,能,能最,大,大限,度,度地,保,保存RNA，,且对,组,组织,结,结构,有,有损,伤,伤。,戊二,醛,醛：能较,好,好地,保,保存RNA和,组,组织,形,形态,结,结构,，,，但,由,由于,和,和蛋,白,白质,产生广泛,的,的交叉连,接,接，从而,影,影响了核,酸,酸探针的,穿,穿透性。,多聚甲醛,：,：仍被公认,为,为ISHH较为理,想,想的固定,剂,剂。,多聚甲醛,mRNA的定,位,位,将组织固,定,定于4%,多,多聚甲醛,磷,磷酸缓冲,液,液中12h，在,冷,冷冻前浸,入,入15%,蔗,蔗糖溶液,中,中，置4,冰箱过,夜,夜，次日,切,切片或保,存,存在液氮,中,中待恒冷,箱,箱切片机,或,或振荡切,片,片机切片,。,。,组织也可,在,在取材后,直,直接置入,液,液氮冷冻,，,，切片后,才,才将其浸,入,入4%多,聚,聚甲醛约10min，空气,干,干燥后保,存,存在-70。如,冰,冰箱温度,恒,恒定，在-70,可,可保存数,月,月之久不,会,会影响杂,交,交结果。,病理学活,检,检取材,福尔马林,固,固定和石,蜡,蜡包埋，,这,这种标本,对,对检测DNA和mRNA有,时,时也可获,得,得杂交信,号,号。,石蜡包埋,切,切片由于与蛋,白,白质交叉,连,连接的增,加,加，影响,核,核酸探针,的,的穿透，,因,因而杂交,信,信号常低,于,于冰冻切,片,片，同时,，,，在包埋,的,的过程中,可,可减低mRNA的,含,含量。,冷冻切片,应用多聚,甲,甲醛蒸汽,固,固定干燥,后,后的冷冻,切,切片也可,获,获得满意,效,效果。,2 玻片,和,和组织切,片,片的处理,（1）玻,片,片的处理,热肥皂刷,洗,洗,自,自来水,清,清洗,清,清洁,液,液中浸泡24h,清,清,水,水洗净,烘,烘,干,干95%酒精,中,中浸泡24h,蒸,蒸,馏,馏水冲洗,烘,烘干,烘箱温度,150,过,过夜以去,除,除RNA,酶,酶,盖玻片硅,化,化处理,锡箔纸包,裹,裹无尘存,放,放,（2）增,强,强组织的,通,通透性和,核,核酸探针,的,的穿透性,根据应用,固,固定剂种,类,类、组织,种,种类、切,片,片厚度和,核,核酸探针,长,长度而定,。,。,常用方法,：,：,稀释的酸,洗,洗涤、去,垢,垢剂或称,清,清洗剂Triton X-100,、,、酒精或,某,某些消化,酶,酶等。,优点:,通过去蛋,白,白作用增,强,强组织通,透,透性和探,针,针的穿透,性,性,提高,杂,杂交信号.,缺点:,减低RNA的保存,影响组,织,织结构形,态,态.因此,，,，在用量,及,及孵育时,间,间上应慎,为,为掌握。,（3）减,低,低背景染,色,色,预杂交（Prehybridization,）,）:,是减低背,景,景染色的,一,一种有效,手,手段。预,杂,杂交液和,杂,杂交液的,区,区别在于,前,前者不含,探,探针和硫,酸,酸葡聚糖,。,。将组织,切,切片浸入,预,预杂交液,中,中可达到,封,封闭非特,异,异性杂交,点,点的目的,，,，从而减,低,低背景染,色,色。,杂交后洗,涤,涤:,采用低浓,度,度的RNA酶溶液,（,（20g/ml,）,）洗涤一,次,次，去除,残,残留的和,内,内源性的RNA酶,，,，减低背,景,景染色。,（4）防,止,止RNA,酶,酶的污染,在整个杂交,前,前处理过程都需,戴,戴消毒手套。,所有实验用,玻,玻璃器皿及镊子,都,都应于实验前一,日,日置高温烘烤,消除RNA酶,亦可用消毒锅,。,。,要破坏RNA酶，最低温度,必,必须在150,左,左右。,消毒的玻璃,器,器皿外包以锡箔,纸,纸以利于标记和,防,防止取出,时空气污染。,杂交前及杂,交,交时所用的溶液,需,需经高压消毒处,理,理。,3 杂交（Hybridisation）,杂交:核酸探针进入细,胞,胞或组织与其内,的,的靶核苷酸相结,合,合。,是ISHH中关,键,键的而且是最重,要,要的一个环节。,杂交方式:是将杂交液滴于,切,切片组织上，加,盖,盖硅化的盖玻片,。,。,加盖片的目的,防止孵育过程中,的,的高温（50,左,左右）导致杂交,液,液的蒸发;,硅化的盖玻片的,优,优点是清洁无杂,质,质，光滑,无气,泡,泡,不会影响,组织切片与杂交,液,液的接触;,盖玻片自身重量,能,能与杂交液吸附,达,达到覆盖和防蒸,发,发的作用。,杂交注意环节,（1）探针的浓,度,度,原则:探针浓度必须给,予,予该实验最大的,信,信/噪比值。最,佳,佳原,则应是应用最低,探,探针浓度以达到,与,与靶核苷酸的最,大,大饱和结合,度为目的。,杂交液的量要适,当,当:,以1020l/每张切片为,宜,宜。,杂交液过多浪费,，,，且液量过多常,易,易致盖玻片滑动,脱,脱落,过量,的杂交液含核酸,探,探针浓度过高，,易,易导致高背景染,色,色等后果。,（2）探针的长,度,度,最佳长度应在50100个碱,基,基之间。,探针短-,易,易进入细胞，杂,交,交率高，杂交时,间,间短。,500个碱基的,探,探针-杂,交,交时间约需20h左右。,200500,个,个碱基的探针-可应用.,超过500个碱,基,基的探针-,在,在杂交前最好,用,用碱或水解酶进,行水解，使其变,成,成短的片段，,达到实验所需求,的,的碱基数。,（3）杂交的温,度,度和时间,杂交温度：,DNA或RNA需加热或变,性,性、解链后才,能,能进行杂交。,原,原位杂交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90、95,，,，这种高温对,保,保存组织形态,完,完整和保持组,织,织切片粘附在,载,载玻片上是不,可,可能的。因此,，,，在杂交液中,加,加入盐和甲酰胺，减低Tm。,根,根据探针的种,类,类不同，温度,略,略有差异。,杂交时间：,16-20h,或,或孵育过夜,甲酰胺：在杂交液中占50%左右；,调,调节杂交反应,温,温度，利于保,持,持组织形态结,构,构；防止低温,时,时非同源性片,段,段结合；但具,有,有破坏氢键的,不,不稳定作用。,硫酸葡聚糖：在核酸杂交液,中,中硫酸葡聚糖,占,占10%左右,；,；是一种大分,子,子的多聚胺化,合,合物，具有极,强,强的水合作用,，,，因而能大大,增,增加杂交液的,粘,粘稠度；促进,杂,杂交率，特别,是,是对双链核酸,探,探针。,甲酰胺和硫酸,葡,葡聚糖：,（4）杂交严,格,格度（Hybridization stringency）,杂交严格度：表示通过杂交,及,及冲洗条件的,选,选择对完全配,对,对及不完全配,对,对杂交体的鉴,别,别程度。,错配对杂交的,稳,稳定性较完全,配,配对杂交体差,，,，因此，通过,控,控制杂交温度,、,、盐浓度等，,可,可减弱非特异,性,性杂交体的形,成,成，提高杂交,的,的特异性。所,以,以，杂交的条,件,件愈高，特异,性,性愈强，但敏,感,感性降低，反,应,应亦然。,低严格度：杂交及冲洗条,件,件在Tm35,40之间,，,，高盐或低甲,酰,酰胺浓度。大,约,约有70%90%的同源,性,性核苷酸序列,被,被结合，可导,致,致非特异性杂,交,交信号的产生,。,。,中严格度：Tm 20-30的范围,。,。,高严格度：为 Tm10-15，低,盐,盐和高甲酰胺,浓,浓度。只有具,有,有高同源性的,核,核苷酸序列才,能,能形成稳定的,结,结合。,4 杂交后处,理,理,包括系列不同,浓,浓度，不同温,度,度的盐溶液的,漂,漂洗。,目的：通过杂交后的,洗,洗涤将组织切,片,片中非碱基配,对,对除去，有效,地,地减低背景染,色,色，获得较好,的,的反差效果。,洗涤的条件：如盐溶液的浓,度,度、温度、洗,涤,涤次数和时间,因,因核酸探针的,类,类型和标记的,种,种类不同而略,有,有差异，一般,遵,遵循的共同原,则,则是盐溶液浓,度,度由高到低，,而,而温度则由低,到,到高。,注意事