单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,志贺氏菌的检验,一、流行病学简介,一种古老的肠道传染性腹泻。19世纪曾出现全世界菌痢的大流行。,1899年，日本人志贺氏首先发现菌痢是由痢疾杆菌引起。,第一次世界大战期间（1914-1918年），德国死于痢疾者约4万余人，并进一步证实痢疾杆菌是菌痢流行的病原。,细菌性痢疾历年来一直是我国夏秋季发病率最高的肠道传染病。,近年来报道非洲及中美洲流行的痢疾志贺菌病死率达5%-15%。,我国属发展中国家，人民的生活条件虽然在不断改善，但由于部分地区卫生知识普及不够，食品卫生管理、监督不力，使得志贺菌的感染在我国传染病中多年来一直处于较高的地位。,每年均有志贺菌感染暴发的报告，每次暴发的发病人数在数十人到上千人不等。多数由于,食物和饮水,污染引起。,1994年5月11日，江苏省无锡市发生一起26所小学的学生因课间餐食用豆奶导致1345人食物中毒的事故，后经调查是一起志贺菌和致病性大肠杆菌混合感染引起的食物中毒，此次爆发波及范围之大，发病人数之多，在我国历史上颇为少见。,志贺菌致病力强，少量细菌进入人体即可引起发病。是否发病，取决于细菌数量、致病力（粘附、侵袭力、毒素）和人体的抵抗力。,各种志贺菌都可以产生强烈的内毒素，是引起全身毒血症的主要因素。志贺菌还可产生外毒素（志贺毒素），具有神经毒、细胞毒和肠毒性作用，能引起更严重的临床表现如溶血性尿毒综合症等。,二、生物学特性,（一）、形态与染色,革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛,23um*0.50.7um,（二）、培养特性,1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37,，,PH7.27.4,2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落,3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。,4,、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。,（三）、生化反应,1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。,2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。,3、不产生H,2,S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。,4、甲基红阳性。,（,四）、抗原结构,1,、抗原构成：,O抗原：,群特异性抗原：A、B、C、D,K抗原：除B群外，一般有K抗原,2、志贺氏菌的分群与血清型,志贺氏菌分为四群：,A群（痢疾志贺氏菌）：110型,B群（福氏志贺氏菌）：16型+X、Y两个变种，,C群（鲍氏志贺氏菌）：115型,D,群（宋内氏志贺氏菌）,：,1,个型,三、,志贺氏菌检验,GB 4789.5-2012,1.,以原国标为基础，保持与原标准的连续性,考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法,2.与国际接轨的原则,该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准，部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准,3.与现有已颁布的新版国家标准协调统一,参考了已颁布的2008版国标，在样品的前处理步骤，培养条件的选择，文字描述等方面尽量 保持一致。,GB/T 4789.5-2003标准不足处,1.采用GN增菌肉汤,37需氧培养,4小时后大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌,检测效果较差,2.使用的分离平板SS对志贺1型有抑制,3.检验方法与现行的其它国家的标准存在差异,增菌：用GN增菌液使处于濒死状态的细菌恢复活力,选择性平板分离培养：XLD+MAC/显色培养基,生化试验：可采用API 20E或VITEK2,血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种。,志贺氏菌操作流程,修 改 的 内 容,增菌部分,志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL）,原国标：GN,ISO ：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5,g/mL）,FDA：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5,g/mL 和3 g/mL）,NMKL：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL）,培养条件,：41.51 厌氧培养,原国标：37需氧培养,ISO：41.5厌氧培养,FDA：42（除宋内其他志贺菌)和44（宋内）厌氧培养,NMKL：42厌氧培养,分离用平板,原国标：HE或SS;MAC或EMB,ISO：MAC、XLD、HE,FDA：MAC,NMKL：MAC、XLD、HE,（一）增 菌 培 养,用志贺氏菌增菌液增菌,41.5，16 h20 h厌氧培养。,智能厌氧微需氧培养系统,（二）分 离 培 养,取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或R&F志贺氏菌显色培养基平板上,于36,1 培养20 h24 h，观察各个平板上生长的菌落形态,若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48 h再进行观察。,菌 落 特 征,MAC琼脂：无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐，直径23 mm,XLD琼脂：粉红色至无色，半透明、光滑、,湿润、圆形、边缘整齐或不齐，直径1 2 mm,R&F志贺氏菌显色琼脂：白色，不透明、圆形、边缘不整齐，直径1 mm3 mm，菌落周围琼脂颜色变为紫红色,志 显,1 宋内氏典型菌落,XLD,2 福氏典型菌落,志显,XLD,XLD,3,鲍氏典型菌落,志显,XLD,4 痢疾典型菌落,志显,5 熟肉制品中宋内的分离效果,R&F志显,XLD,志显,6 蔬菜制品中宋内分离效果,XLD,志显,7 鲍氏在生肉中的分离效果,XLD,8 熟肉制品中福氏的分离效果,志 显,（四）初 步 生 化,选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固体、营养琼脂斜面，36,1 培养20 h24 h，观察结果。,培养物中出现以下情况可以弃去,a.在三糖铁琼脂斜面上蔓延生长,b.发酵乳糖或蔗糖,c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的,d.产气的,e.产生硫化氢,f.有动力的培养物,初步生化:三糖铁（TSI）,现象,说 明,底层,黄色,葡萄糖阳性,红色或不变色,葡萄糖阴性,黑色,产H,2,S,气泡,产气,斜面,黄色,乳糖和（或）蔗糖阳性,红色或不变色,乳糖和（或）蔗糖阴性,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H,2,S。如图中2号管的反应.,生化反应,A,群：痢疾志贺氏菌,B,群：福氏志贺氏菌,C,群：鲍氏志贺氏菌,D,群：宋内氏志贺氏菌,-,半乳糖苷酶,c,c,尿素,赖氨酸脱羧酶,鸟氨酸脱羧酶,a,水杨苷,七叶苷,靛基质,/,(,),/,甘露醇,b,棉子糖,甘油,(,),(,),d,注：+阳性；-阴性；-/+多数阴性；+/-多数阳性；（+）迟缓阳性；d有不同生化型。,a 鲍氏13型为鸟氨酸阳性。,b福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。,c痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。,志贺氏菌属四个群的生化特征,附加生化实验,由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（,anaerogenic E.coli,）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 培养24 h48 h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3,（五）生化鉴定,增加了API 20E诊断试剂条和全自动细菌生化鉴定仪VITEK；,（六）血清学鉴定,1.,抗原的准备,志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。,抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。,O抗原为糖脂蛋白复合物，可分为,型特异性抗原,和,群特异性抗原,。志贺氏菌分为4个群，48个血清型（包括亚型及变种）。K抗原在志贺菌属分类上无意义。,菌体（0）抗原,1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分为A,、,B,、,C,、,D四个群及39个抗原型。,2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。,表面抗原（K抗原）,在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热1001小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。,2.凝集反应,3.血清学分型（选做项目）,先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查，福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其相和相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及112各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用118各型因子血清检查。,志贺氏菌的,O,抗原,人们原来的认识认为血清学试验是特异性的，但是志贺氏菌的,O,抗原和大肠埃希氏菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些,O,抗原完全相同。相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。因此，生化试验对于属的鉴定是非常重要的。,志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的O抗原关系,O,抗原完全相同的,：,O,抗原部分相同的:,志贺氏菌属 大肠埃希氏菌 志贺氏菌属 大肠埃希氏菌,A2,。,112ac,A1,1,120.,A3,。,124,A2,149,A4,3588-51,A3,164.,A5,58,A4,88，159.,A12(3341-55),152 A6 130,B2b 147ab A7 121,B3a 5444-80 A8 38,23,B4b 135 A10 .144,B5 129 A11 29,C1 149 A12 3,C4 53 B群 1,2,13,16,17,19,62,69,73,3438-51,C5 79 C1 2,(50),C7 4838-69 C2 87ab,96,C8 143 C3 85,C11 105ab C4 149,C14 32 C6 76,C15 112ab C9 102,C10 105ac,C12 7,C13 28ac,98,C15 83,C16 47,C17 124,C18 29,可能,结果报告,综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌属。,