,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物生理学实验,西南科技大学生命科学与工程学院,植物生理是实践性很强的学科，学生必需通过实验、实习才能加深对理论课的理解，并为后续专业课的学习打好基础，同时，通过实验、实践可以提高学员观察问题和解决问题的能力，提高学员的动手能力及独立思考、分析问题的能力；,在实验课中要通过实例论述论证，让学生认识到实验的重要性，培养学生对实验课的兴趣；系统介绍植物生理的一般研究方法和基本技术；,一、植物生理学实验的基本要求,重视培养学生的实际操作技能，不片面追求实验数据的准确性，培养学生实事求是的科学态度。对一些不能开设的实验，通过演示实验的方式，拓宽学生视野，完善实验内容。,学生都应参加实验实习环节，选作部分实验，了解植物生理的主要测试技术，在教师的指导下，独立或团队操作，完成实验内容并用所学的知识，综合分析，写出实验报告，解释有关现象并讨论实验结果。实验课程单独考核，单独记成绩。,一、植物生理学实验的基本要求,二、植物生理学实验的目录,实验一 种子生活力的快速测定,-4,学时,实验二 小蓝子法测定植物的呼吸速率,-4,学时,实验三 叶绿素,a,、,b,含量的测定,-4,学时,实验四 植物抗逆性的鉴定,（电导仪法、丙二醛含量的测定、植物根系,POD,活性的测定）,-12,学时,实验五 改良半叶法测定植物光合速率（选做）,-4,学时,实验六 谷类种子萌发时淀粉酶活性的测定（选做）,-4,学时,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),种子生活力：,是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。没有生活力的种子是死亡的种子，不能萌发。,种子寿命：,种子从发育成熟到丧失生活力所经历的时间。,种子寿命既与植物种类有关，也与贮藏条件（种子含水量、贮藏温度）有关。,正常性种子：水稻、玉米、小麦等种子（,1-3,年）,短寿命： 柳树种子（,12h,）,长寿命： 莲子（,400,年）,贮存条件：低温、低湿，保存时间长,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),种子生活力检测评估方法,(1),还原力：呼吸,NADH ,还原,TTC,，胚呈红色。,(2),原生质着色：活种子不易着色，原生质膜具有选择透性。,(3),呼吸释放,CO2,，,pH,下降，酸碱指示剂显色。,(4),细胞中的荧光物质：紫外照射发蓝、蓝紫色荧光。,(5),外观目测法：用肉眼观察玉米种胚形状和色泽。凡种胚凸出或皱缩、显黑暗无光泽的，则种子新鲜，生活力强，可作生产用种。,(6),浸种催芽法,先将,100,粒种子用水浸约两小时吸胀，放于湿润草纸上，盖以湿润草纸，置于氧气充足，室温,10-20,环境中，让种子充分发芽；再以发芽的种子粒数除以,100,，乘以,100%,，求得发芽率。,这种测定方法虽然准确，但需要,8,天时间。,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验目的,了解种子活力测定生产意义,掌握重要种子活力测定方法和评价标准,理解,TTC/,染料法测定种子活力的原理,实验原理,TTC,法,当,TTC,溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（,NADH,或,NADPH,）还原时，可产生红色的三苯甲腙（,TTF,），胚染成,红色；,如果种胚死亡则,不能染色,，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则,染色较浅或局部被染色。,染料染色法,有生命力种子,胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，,胚部不染色；而丧失生命力的种子，,其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可以自由进入细胞内，,使胚部染色。,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验材料及药品,不同活力的玉米和小麦种子,0.5%,氯化三苯四氮唑法（,TTC,法）,红墨水（稀释,20,倍）,刀片,培养皿,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验步骤,一、氯化三苯四氮唑法（,TTC,法）,1,、原理,凡是生活细胞，就有新陈代谢。渗入生活细胞的无色的,TTC,能被脱氢辅酶（,NADH,2,或,NADPH,2,）上的氢还原成红色产物（,TTF,），肉眼可辨。,2,、材料：玉米、小麦（吸胀种子）,3,、方法：,100,粒种子，沿中心线纵切为二，做如下处理：,100,半粒,+ 0.5 % TTC,30,，,60 min,检查,100,半粒,煮沸,5 min,注意：胚为红色的为具活力种子。,4,、作业：计数活种子数，计算活种子的百分率。,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验步骤,二、红墨水染色法,1,、原理,生活细胞的原生质膜对物质吸收有选择性，而死细胞的无此功能，红墨水颗粒可以进入。,2,、材料：玉米、小麦（吸胀种子）,3,、方法,种子,100,粒，沿中心线纵切为二，做如下处理：,100,半粒,+5%,红墨水室温, 60 min,检查,100,半粒煮沸,5 min,注意：胚部着色（红色）很浅或不着色者为生活种子，胚与胚乳着色程度相当者为死种子。,4,、作业：计数活种子数，计算活种子的百分率。,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验要点,1,、种子要先软化；,2,、种子要沿种胚纵切为两半；,3,、显色时要使漂浮的种子全部浸入试剂中；,4,、,TTC,见光易分解，需在暗条件下保温染色；,5,、结果观察主要是看胚部的颜色变化。,实验一 植物种子生活力的快速测定,(TTC,法、染料染色法,),实验结果分析,比较两种种子活力的高低,比较分析两种方法测定结果的差异,植物种子活力测定的其它方法,实验二,植物呼吸速率的测定,小篮子法,一、实验目的与要求,掌握小篮子法测定植物种子呼吸速率的原理与步骤；,比较活种子与死种子的呼吸速率,。,二、实验原理,1,、植物的呼吸作用,定义：,是植物体吸收氧气，将有机物转化成二氧化碳和水并释放能量的过程。,葡萄糖,+6O,2,6CO,2,+6H,2,O+,能量,意义： 代谢的中心,有机物转化的枢纽,能量的主要供应渠道,2,、测定呼吸速率的常用方法,红外线,CO,2,气体分析仪,(IRGA),CO,2,可以吸收特定波段的红外辐射。当被检,CO,2,气体通过,IRGA,的气室时，可使红外辐射减少或增加，且变化幅度取决于,CO,2,的浓度。这种变化可被,IRGA,的检测器所检定，且以电讯号的形式输出，由记录仪所记录,。,氧电极法,3,、小篮子法,密闭容器中加入一定量碱液,一般用,Ba(OH),2,，并悬挂植物材料，则植物材料呼吸放出的,CO,2,可为容器中,Ba(OH),2,所吸收，然后用草酸滴定剩余的,Ba(OH),2,，从空白和样品二者消耗的草酸溶液之差，可计算出呼吸释放的,CO,2,量,具体反应式：,Ba(OH),2,+CO,2,BaCO,3,+H,2,O,Ba(OH),2,+H,2,C,2,O,4,BaC,2,O,4,+2H,2,O,以,酚酞,指示滴定终点。,1mL,的,1/44mol/L,草酸溶液中的草酸与,1mg,的,CO,2,等摩尔数。,空白和样品二者消耗的草酸溶液的,mL,数差值,=,Ba(OH),2,溶液吸收的,CO,2,mg,数,=,种子呼吸作用释放的,CO,2,mg,数,三、实验材料与试剂,材料,小麦种子（浸种）和煮死的种子,的小麦或绿豆种子；,试剂,0.05mol/L,的,Ba(OH),2,；,1/44mol/L,的草酸；,酚酞指示剂。,1#,种子,2#,实验装置图,四、实验步骤,取具玻璃塞和橡皮塞的,500mL,广口瓶各,1,只，分别编号,1#,、,2#,；,2.,分别称取,10g,煮死种子和浸种活种子，以纱布包裹，悬挂在橡皮塞下方；,3.,向两瓶内各加入,Ba(OH),2,溶液,20mL,，,立即,封口，室温放置。,1#,种子,2#,实验装置图,不时轻摇两瓶，,1h,后，拔除瓶塞，各加,酚酞,指示剂,2,滴，,立即,以塑料袋（保鲜膜）分别封口；,将滴定管下端插入瓶中，以草酸滴定,Ba(OH),2,，记录所用草酸体积,V,1,和,V,2,。,五、计算,呼吸速率,(mgCO,2,/gFW.h),=(V,1,-V,2,)/(W t),六、思考题,在本实验呼吸测定怎样排除不应有的干扰因素？,在实验过程中为什么要轻摇广口瓶数次？,就计算公式而言，为什么草酸的用量可代表种子呼吸放出的,CO,2,的量？,草酸（,1/44 mol/L,）滴定,Ba(OH),2,(0.05 mol/L),，酚酞作指示剂，溶液由紫色变成无色，滴定至终点后，马上颜色又由无色变成紫色，原因是什么？,白天在实验室测定植物茎叶的呼吸速率会受到什么影响？如何解决？,如果实验材料选择的是不同萌发阶段的小麦种子及幼芽，哪一阶段的呼吸速率最大？（结合实验,1,进行分析）,实验三,叶绿体色素的提取、分离、性质及含量测定,一、实验目的,掌握叶绿体色素的提取原理及方法；,掌握叶绿体色素的部分理化性质；,掌握叶绿体色素定量分析方法及步骤。,二、实验原理,2.,类胡萝卜素,（一）叶绿体色素：,胡萝卜素,叶黄素,叶绿素,a,叶绿素,b,1.,叶绿素,（二）四种色素的化学性质,均为亲脂性,亲水性：,均不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。,极性大小：,叶绿素,b,叶绿素,a,叶黄素,胡萝卜素,根据相似相溶原理，在有机溶液中的溶解度：,叶绿素,b,叶绿素,a ,叶黄素,胡萝卜素,叶绿素的卟啉环,叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为,Mg,2+,。,在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁可被,H,+,取代而形成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则可形成绿色的铜代叶绿素。,铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做植物的原色标本。,（三）叶绿素的光学性质,叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。,叶绿素的荧光现象,叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。,三、实验材料与试剂,实验材料,：,绿色植物叶片,实验仪器及试剂,：,UV-1700,分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；,95%,乙醇；石英砂；,CaCO,3,；,醋酸铜,四、实验步骤,1,、 叶绿体色素提取,将植物叶片,擦净,，去中脉后取,5g,剪碎，加少许碳酸钙和石英砂，再,分次,加入,10mL,酒精,研磨，过滤，定容至,50ml,，分装于,5,个试管内，容量分别为,10ml,。,2,3,4,5,1,2.,水研磨匀浆（光破坏对照）,取,2g,剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加,2ml,蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水,20ml,，搅均，不过滤，分装在,2,个试管内。,四、实验步骤,光对叶绿素的破坏操作,太阳光下 ：水（,1,）、乙醇（,1,）,暗处（实验台）：水（,2,）、乙醇 （,2,）,两组（四管）,3.,光对叶绿素的破坏作用,30,分钟后观察各试管颜色的变化，并记录，解释现象,水研磨匀浆,暗,光,乙醇提取液,暗 光,注意：,乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，稀释倍数视提取液的浓度确定，浓度不要过大，否则在短时间之内效果不明显。,4,、叶绿素提取液荧光现象观察,取试管,3,：,从与入射光垂直的方向观察；,再在透射光方向观察叶绿体色素溶液的颜色；,记录叶绿素体色素溶液颜色有何不同 ，分析原因。,5,、铜代叶绿素反应,向,试管,4,中,逐滴,加入浓盐酸，并不断摇匀，至颜色变化，观察并记录现象；,向变色后的叶绿素溶液中加入,少量,醋酸铜，并在酒精灯上缓缓加热，观察并记录颜色的变化。,分析原因。,6,、叶绿素定量测定,稀释叶绿素,取,5,号试管醇提取液,5ml,转入,50ml,容量瓶中（或更大，视浓度而定），再加入乙醇定容至,50ml,。,测量光吸收,利用722分光光度计或,UV1700,分光光度计,，,分别测定叶绿素提取液在645,nm,和663,nm,下的吸光度。,实验原理,叶绿素提取液中同时含有叶绿素,a,和叶绿素,b，,二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素,a,和叶绿素,b,的情况下同时测定叶绿素,a,和叶绿素,b,的浓度，可分别测定在663,nm,和645,nm（,分别是叶绿素,a,和叶绿素,b,在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据,Lambert-Beer,定律，计算出提取液中叶绿素,a,和叶绿素,b,的浓度。,A,663,=82.04C,a,+9.27C,b,（1）,A,645,=16.75C,a,+45.60C,b,（2）,公式中,Ca,为叶绿素,a,的浓度，,Cb,为叶绿素,b,浓度（单位为,g/L），82.04,和9.27分别是叶绿素,a,和叶绿素,b,在663,nm,下的比吸收系数（浓度为1,g/L，,光路宽度为1,cm,时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素,a,和叶绿素,b,在645,nm,下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。,实验原理,将上式整理，可以得到下式：,C,a,=0.0127A,663,-0.00269A,645,（3）,C,b,=0.0229A,645,-0.00468A,663,（4）,将叶绿素的浓度改为,mg/L，,则上式变为：,C,a,=12.7A,663,-2.69A,645,（5）,C,b,=22.9A,645,-4.68A,663,（6）,C,T,=C,a,+C,b,=8.02A,663,+20.21A,645,（7）,C,T,为叶绿素的总浓度,实验原理,定量测定结果分析,将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素,a、,叶绿素,b,和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量：,叶绿素,a,含量(,mg/g,鲜重),Ca500ml（,总体积数）1,ml/1000ml/L 5g=,0.1C,a,叶绿素,b,含量(,mg/g,鲜重)0.,1C,b,总叶绿素含量(,mg/g,鲜重)0.,1C,T,五、思考题：,1,、用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取干燥材料中的叶绿体色素，结果会如何？为什么？,、研磨提取叶绿素时，为何要加入,CaCO,3,？,3,、铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用，这有何实用意义？,4,、计算叶绿素,a,与叶绿素,b,含量的比值，可以得到什么结论？,实验四,植物组织逆境伤害程度的测定,（提前,20min -20,C,速冻材料 ）,电导法,【,实验原理,】,植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏，而使其透性增大，细胞内各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将植物组织浸入无离子水中，水的电导将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多，电导度的增加也愈大。故可用电导仪测定外液的电导度增加值，从而得知伤害程度。,校园中任意一种植物叶片,电导法,【,实验材料,】,电导法,【,实验方法,】,1,实验分两个处理：,对照：正常植物叶片,低温：低温（,-20,）处理,20min,的叶片,2,冲洗叶片，用滤纸吸干，打取 叶圆片。每个试管,10,片叶，加入,15ml,蒸馏水后放入塑料沙网（,距液面,1cm,）统一抽气,20min,。,3,抽完气后，平衡,20-30min,，其间不断摇动。,4,电导仪测定初电导值,S1,。,5,沸水浴,10min,，自来水冷却（杀死植物组 织），平衡,10min,（其间不断摇动）后即可测定终电导,S2,。,【,实验方法,】,取材 各,3,片叶 打取叶圆片,10,片,/,管，,15mL,蒸馏水,/,管,抽气,20min,平衡,20-30min,测量,S1,煮沸,15min,冷却 平衡,10min,测量,S2,【,实验步骤示意图,】,相对电导度：,L=,（,S,1,-,空白电导）,/,（,S,2,-,空白电导）,伤害度（,%,）：,(L,t,-L,ck,/1-L,ck,)*100,【,结果计算,】,1,蒸馏水中加吐温,(,可用洗衣粉代替），洗仪器时出现泡沫。,吐温作用：表面活性剂，促进细胞间隙水分与外界交换。,2,抽气作用：抽出细胞间隙空气，保证水分充分进入细胞间隙。,3,纱网作用：防止抽气时叶圆片被抽出。,【,注意事项,】,测定电解质外渗液时，为何要对材料进行真空渗入？测定过程中为何进行震荡？,【,思考题,】,一 原 理,植物器官在逆境条件下或衰老时,往往发生膜脂过氧化作用,丙二醛,(MDA),是其中产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标,用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。,植物组织中丙二醛含量的测定,丙二醛,(MDA),硫代巴比妥酸,(TBA),高温酸性,三甲基复合物,(3,5,5-,三甲基恶唑,2,4-,二酮,),(,红棕色,),上述反应在,532nm,处有最大吸收波长,但此反应受可溶性糖的极大干扰：,糖与,TBA,的反应产物在,532nm,处也有吸收,(,糖与,TBA,反应产物的最大吸收波长在,450nm,处,),所以，测定,MDA,含量时需排除可溶性糖的干扰,根据,Lambert-Beer,定律，对最大吸收光谱不同的两个组分的混合液,代入数值，计算得出混合液中两种组分的浓度公式：,可溶性糖：,C,1,/(mmol/L)=11.71 OD,450,MDA,：,C,2,/(mol/L)=6.45 OD,532,0.56 OD,450,二 材料、仪器设备及试剂,(,一,),材料,植物叶片,(,常温和低温两种状态,),(,二,),仪器设备,研钵,试管,移液管,恒温水浴锅,离心机,分光光度计,(,三,),试剂,10 %,三氯乙酸,(TCA),0.6%,硫代巴比妥酸,(TBA),三 实验步骤,(1)MDA,的提取,取,0.5g,叶片剪碎，加,10% TCA 2ml,和少量石英砂，研磨，进一步加入,3ml TCA,充分研磨，匀浆液以,4000r/min,下离心,10min,，上清液即为提取液，定容至,10ml,。,(2),显色反应及测定,吸取上清液,2ml,，加,2ml 0.6% TBA,，混匀，在沸水浴中煮沸,15min,，迅速冷却，在,4000r/min,下离心,5min,。取上清液测定,532nm,和,450nm,下的,OD,值。,对照以,2ml TCA,代替提取液。,四 结果计算,以测得的,OD532,减去,OD600,的非特异吸收值，按,155mmol,-1,cm,-1,消光系数计算,MDA,含量。 分别计算衰老和对照组的值。,MDA,浓度,(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450,MDA,含量,(mol/g FW),D450,、,D532,、,D600,分别代表,450nm,、,532nm,和,600nm,波长下的光密度值。,五 注意事项,0.1-0.5,的三氯乙酸对,MDA-TBA,反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；,MDA-TBA,显色反应的加热时间，最好控制沸水浴,10-15min,之间。时间太短或太长均会引起,532nm,下的光吸收值下降；,如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。,低浓度的铁离子能增强,MDA,与,TBA,的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充,Fe,3+,（最终浓度为,0.5 nmolL,-1,）,可溶性糖与,TBA,显色反应的产物在,532 nm,也有吸收（最大吸收在,450 nm,），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。,思考题,1.,通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？,2.,说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。,3. TBA,为什么要溶解在三氯乙酸中？,4.,为什么要测定反应液在,600nm,下的吸光度？,5.,丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？,6.,如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？,7.,植物正常叶片与低温冻害叶片相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。,过氧化物酶活性的测定,愈创木酚比色法,一、实验目的,1.,学习比较植物根系或叶片过氧化物酶的制备方法,2.,掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。,二、实验原理,什么是过氧化物酶,?,过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。,一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。,这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以,过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标,。,酶活力,表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量,(g),或体积,(ml),。因为酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力,(,活性,),表示。,酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力。催化能力强,(,大,),，酶活力就高,(,大,),，也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。,二、实验原理,酶促反应速度,酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下,(,最适,pH,、最适,T),酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈慢，酶的活力就愈低。,所以测定酶的活力,(,实质上就是酶的定量,),测定就是测定酶促反应的速度,(,用,v,表示,),。,酶促反应速度可用,单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示,。单位：浓度,/,单位时间,常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显。酶促反应随时间增加，产物增加。,二、实验原理,酶促反应的速度曲线,Vmax,时间,产物的生成量,斜率浓度,/,时间,V,从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。,引起下降的原因很多，如,底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用,等。,因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。,即从原点对曲线作切线，求切线斜率,( v ) =,浓度,/,时间,二、实验原理,测定原理,RH,2,+ H,2,O,2,2H,2,O + R,在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在,470 nm,处有最大吸收，可用分光光度计测量,470 nm,处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。,三、实验材料,校园中任意一种植物根系或叶片 （正常和冻害两种状态）,四、仪器用品与试剂,仪器,分光光度计，离心机，天平，电热恒温水浴锅，研钵，移液管，吸管,试剂,(1) 0.05M,磷酸缓冲液,(pH5.8),(2) 0.05M,愈创木酚溶液,(3) 2%H,2,O,2,溶液,磷酸缓冲液,试剂：,NaH,2,PO,4,2H,2,O Na,2,HPO,4,12H,2,O,配制方法：配制时，常先配制,0.2mol/L,的,NaH,2,PO,4,和,0.2mol/L,的,Na,2,HPO,4,，两者按一定比例混合即成,0.2mol/L,的磷酸缓冲液。,（,1,）,0.2mol/L,的,NaH,2,PO,4,；称取,NaH,2,PO,4,2H,2,O 31.2g,加重蒸水至,1000ml,溶解。,（,2,）,0.2mol/L,的,Na,2,HPO,4,：称取,Na,2,HPO,4,12H,2,O 71.632g,加重蒸水至,1000ml,溶解。,五、实验步骤,1,、称取植物材料各,0.1-0.2g,，剪碎，放入研钵中，加入,5ml,磷酸缓冲液研磨成匀浆，转移至,10mL,离心管，另取,5mL,磷酸缓冲液冲洗研钵一并转入离心管，以,4000 rpm,离心,15 min,，上清液即为粗酶液,用磷酸缓冲液定容至,25ml,。,(,先定容至,25ml,若酶活性较高，可取,1ml,稀释,2,倍成,2ml,再进行测定,),3,、取粗酶液,0.1mL,，加入反应混合液,2 mL+,磷酸缓冲液,0.9mL,，立即于,470 nm,处测定吸光度（,OD,）值，每隔,0.5min,读数一次。,试管号,反应混合物,磷酸缓冲液,酶液,30s,60s,90s,120s,1,2ml,（愈创木酚,H,2,O,2,各,1ml,）,1ml,2-3,2ml,（愈创木酚,H,2,O,2,各,1ml,）,0.9ml,0.1ml,（根）,4-5,2ml,（愈创木酚,H,2,O,2,各,1ml,）,0.9ml,0.1ml,（叶片）,六、实验结果,式中：,A,470,反应时间内,OD,变化值。,V,T,提取酶液总体积（,25mL,）。,W,植物鲜重（,0.1-0.2g,）。,t ,反应时间（,min,）。,V ,反应体积（,0.1ml),过氧化物酶活性,=,A,470,V,T,V,Wt,七、思考题,说明植物过氧化物酶在植物代谢中的意义。,测定酶的活力要注意控制哪些条件？,