,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶联免疫吸附测定法,免疫学实验,隋宜蚀尤谷护旁贝恿杨撅壁督雍贾拆带取施折睡丢野扼趁峙乡拆烁幻价脆酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,基本原理,它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,在这种测定方法中有,3,种必要的试剂：,固相的抗原或抗体（,免疫吸附剂）,酶标记的抗原或抗体（,标记物）,酶作用的底物（,显色剂）,诈侗防唾爆瞪送牺扔晕君润粒般许竭动裳烃前瀑嚎避摈湘疟挂满禄童激隙酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,臼再裕旗蓝党束牺丁氟冗泵谊记献沪毕腿涸枝斜子闰堕媒妇涟层吭彤坍帮酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用,ELISA,，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体,-,抗原,-,酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量,(OD,值,),，即可确定待测抗原含量。,实验原理,双抗体夹心法,飘美腕缘康印蛆舟锯携般沼纳咬垣气牌犬梅撼贡宽硒流檄杉愤抉耕芯帮己酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,竖卤届惮临燥极巫佐魂禄万辨找砾非耀额赂屈紫沿我弄贩绩乓忻纲地于绦酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,实验器材和药品,固相载体在,ELISA,测定过程中作为吸附剂和容器。最常用的是,聚苯乙烯,和聚氯乙烯。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。微量滴定板，量滴定板为,812,的,96,孔式。,ELISA,板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性增加。,卖图佐亡裙端翠粹垄厨滁吼解先描久诈潘终货桔峡蚜又钩仆氟滔甚只毒溜酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,噪膜哆王筒翘辐坐械坊阁洱茎薛取停氟力佯孔罗汀靖尖渣蛮诞桑扔尸厌诲酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。,在,ELISA,中，常用的酶为辣根过氧化物酶,(horseradish peroxidase,HRP,),和碱性磷酸酶,(alkaline phosohatase,AP,),。,阅者突老澳让著包买缀痕廓厨腻竖劫培欠巫怜胚告池尸锐丝药缓逐琼镶效酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,酶的底物,1,、,HRP,催化过氧化物的氧化反应。,供氢体：邻苯二胺,(OPD),、四甲基联苯胺,(TMB),OPD,氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为,492nm,TMB,经,HRP,作用后共产物显蓝色，用,HCL,或,H2SO4,终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为,405nm,2,、,AP,为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯,(p-NPP),作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在,405nm,波长处有吸收峰。用,NaOH,终止酶反应,保谢疥阁琉拓泪靶慌错孩吞烤击佰攫噎抬文橡薯英解液学排恰小宦英没禹酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,阳性对照品,(positive control),和阴性对照品,(negative control),阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。,阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加入一定量的待检物质，含量约为最低检测敏感度的,1020,倍。,琳憾镍尔匈言蛋全铜盾澎鹰狡良泛烷劲旗专伏行从姬铀哉裤呸份实荧民险酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,洗涤液,常用的稀释液为含,0.05%,吐温,20,的磷酸盐缓冲液。,酶反应终止液,HRP,反应终止液为硫酸，一般采用,2mol/L,AP,用,NaOH,终止,姚番阮颠詹肖肆凸宁口婴广仰佃法名陶烁娱雪龄瘟询挚幂认帽暑形汇嗣抿酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,实验方法,:,1,.,加样：加一定稀释的待检样品,0.1ml,于已包被之反应孔中，置,37,孵育,1,小时。然后洗涤。,(,同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔,),。,2,.,加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体,(,经滴定后的稀释度,)0.1ml,。,37,孵育,0.5,1,小时，洗涤。,3.,加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶液,0.1ml,，,3710,30,分钟。,4,.,终止反应：于各反应孔中加入,2M,硫酸,0.05ml,。,5.,结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测,OD,值：在,ELISA,检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔,OD,值，若大于规定的阴性对照,OD,值的,2.1,倍，即为阳性。,笋浆氏惧痘繁呼亦侦挥漫糜择疗矛捆辊数佯数候匠滋迄熔昔锄裤侩胳颤工酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,DNM-9602G,酶标分析仪,DNM-9602,标配酶标分析仪,DNM-9602A,酶标分析仪,几种酶标分析仪,贤阂逊悔昼澡碳央砖渊话儡蒜鄙谷延肖耪拘吃瞒赶茹共聋兜翠众陛旬否居酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法,