单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017/9/11,#,常见生物医学 软件操作,1.,引物设计,2.graphpad,grism5,数据分析,3.endnote X7,插入文献,4.lightcycler96,实时定量,1.,引物设计,采用,Primer Premier 5.0,进行引物设计,首先打开,Primer Premier 5.0,，输入序列,从,NCBI,里面搜索基因序列，方法如下,PCR,引物设计的原则,1.,引物最好在模板,cDNA,的保守区内设计。,2.,引物长度一般在,1530,碱基之间。,3.,引物,GC,含量在,40%60%,之间，上下游引物,Tm,差值不大于,4,度。,4.,引物,3,端要避开密码子的第,3,位,5.,引物,3,端不能选择,A,，最好选择,T,。,6.,碱基要随机分布。,7.,引物自身及引物之间不应存在互补序列。,发夹结构（,Hairpin,）使引物本身复性。,尤其应避免,3,端的互补重叠以防止引物二聚体（,Dimer,与,Crossdimer,）的形成。引物之间不能有连续,4,个碱基的互补。,引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其,G,值不要过高（应小于,4.5kcal/mol,）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使,PCR,反应不能正常进行。,8.,引物,5,端和中间,G,值应该相对较高，而,3,端,G,值较低。,G,值是指,DNA,双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，,G,值越大，则双链越稳定。应当选用,5,端和中间,G,值相对较高，而,3,端,G,值较低（绝对值不超过,9,）的引物。引物,3,端的,G,值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发,DNA,聚合反应。（不同位置的,G,值可以用,Oligo6,软件进行分析）,9.,引物的,5,端可以修饰，而,3,端不可修饰,10.,扩增产物的单链不能形成二级结构。,11.,引物应具有特异性。,引物设计完成以后，应对其进行,BLAST,检测。,点开红色所指图示,