,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 病毒与亚病毒,第一节 病毒的性质,第二节,病毒的研究方法,第三节,病毒复制,第四节,病毒的非增殖性感染,第五节,亚病毒,第六节,病毒的可利用价值,第三章 病毒与亚病毒,1,第一节 病毒的性质,一、,形态结构,二、,病毒的化学组成,三、病毒的理化抗性,第一节 病毒的性质一、形态结构,2,一、,形态结构,1.形态和大小,形态多样,100nm以下。,2.结构：核(衣)壳+核酸或包膜（来源于核膜或细胞膜）。,一、形态结构,3,衣壳对称类型,螺旋对称,二十面体对称,复合对称,衣壳对称类型螺旋对称二十面体对称复合对称,4,二、,化学组成,（一）病毒的核酸（DNA或RNA）,1.,正极性和负极性,正极性(+RNA)：可作为mRNA。,负极性(-RNA)：与其mRNA序列互补。,双意RNA：正极性+负极性。,DNA：,和mRNA互补,-DNA；和mRNA序列相似,+DNA,。,2.感染性核酸（infectious nucleic acid）,抽提分离的病毒核酸,导入细胞,产生子代毒粒。,二、化学组成（一）病毒的核酸（DNA或RNA）,5,（二）病毒的蛋白质,含量多（40-90%）；种类少（一种或几种）。,1.结构蛋白,如壳体蛋白、包膜蛋白，主要是保护、参与识别和吸附。,2.功能蛋白,如溶菌酶、转录酶等、主要参与侵入、释放或复制。,（二）病毒的蛋白质,6,（三）、脂类和糖类,都来源于细胞；,种类和含量同于宿主细胞（,磷脂+胆固醇,）,;,注：少数无包膜病毒（T系噬菌体、,噬菌体等,）也有脂类。,（三）、脂类和糖类,7,三、理化抗性,1.温度,耐冷不耐热,，离体，5660，30min灭活。,保存：低温真空干燥法(-20-196),；,适量盐溶液（MgCl,2,，MgSO,4,）可提高热稳定性。,2.射线,击毁病毒核酸,。,活性染料（如甲苯胺兰、中性红、丫啶橙）渗入并,与核酸结合,可见光灭活。,3.pH：,5.09.0稳定,。,三、理化抗性,8,4.脂溶剂,破坏包膜,，如乙醚、氯彷,分类的依据。,5.化学消毒剂,对氧化剂（如,高锰酸钾,、,次氯酸盐）,敏感；,酒精、酸碱、环氧乙烷可杀灭。,6.抗生素,不敏感，,但患病须注射。,4.脂溶剂,9,第二节 病毒的研究方法,一、分离与纯化,二、效价测定,第二节 病毒的研究方法一、分离与纯化,10,一、分离纯化,（一）,分离,1.标本采集与除菌处理,（1）采集：,有足够活病毒。,如倒罐液，感染者血液、分泌物等。,（2）除菌处理,采用抗生素、离心、过滤等。,一、分离纯化（一）分离,11,2.,接种与感染表现,（1）接种,考虑宿主范围、组织嗜性；,操作简单、易培养、易判断。,注：,盲传：第一次接种未出现症状，重复接种。,目的：提高效价。,盲传二代后，仍未症状,无活病毒。,2.接种与感染表现,12,（2）感染表现,噬菌斑、坏死斑（枯斑）、蚀斑（空斑）。,噬菌斑（plaque）,噬菌体,平板培养物,圆形的透明区域。,有一定的形态，,用于分离、鉴定和计数,。,噬菌斑,（2）感染表现噬菌斑,13,坏死斑（枯斑）,植物病毒,敏感植物叶片,坏损区域。,蚀斑（空斑）,动物病毒,细胞单层上,病损区。,细胞内部发生“致细胞病变效应”,（细胞聚集成团、肿大、融合成多核细胞，,有包涵体,或裂解）。,坏死斑（枯斑）,14,包涵体(inclusion body),光镜下可见,、圆形、卵圆形或不定形的,蛋白质结晶,。,组成,多为病毒颗粒或病毒亚基；,少为细胞对感染的,反应产物,，,无病毒粒子,。,实践应用,病毒诊断,大小、形态、数量、组成以及位置,快速鉴别,辅助诊断。,用于生物防治昆虫病毒,多角体（,碱性蛋白）,杀虫。,包涵体(inclusion body),15,（二）、病毒的纯化,1.标准,（1）,保持感染性；,（2）大小、形态、密度、组成及抗原性,均一,。,2.方法,盐析、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换等；,超速离心,（二）、病毒的纯化,16,二、效价测定,效价：,指,1mL培养液或试样,中病毒感染单位数目（噬菌斑形成单位数或感染中心数）。,1.物理颗粒计数：,电镜。,2.感染性测定：测噬菌斑、枯斑(,须用石英砂摩擦叶片,)和,蚀斑,数。,二、效价测定效价：指1mL培养液或试样中病毒感染单位数目（噬,17,底层培养基,2-4ml,上层培养基,0.2ml敏感菌悬液,0.1ml噬菌体试样,上层培养液,噬菌斑,37，12h,双层平板法,底层培养基2-4ml上层培养基上层培养液噬菌斑37，12h,18,第三节 病毒复制,一、病毒的增殖过程,二、一步生长曲线,（one-step growth curve）,第三节 病毒复制,19,一、病毒的增殖过程（,E.coli,T,4,噬菌体）,吸附、侵入、生物合成、装配和释放。,（一）吸附,1.特异性,吸附蛋白（VAP）,细胞受体（,细胞生长必须,）。,2.原理：,空间结构的互补性,，氢键、疏水性相互作用、范德华力。,一、病毒的增殖过程（E.coli T4噬菌体）,20,（二）侵入,1.噬菌体：注射。,2.动物病毒,直穿细胞膜；,细胞内吞：累积在细胞质的小泡内,释放；,膜融合：包膜和细胞膜融合。,3.植物病毒：伤口或口器侵入。,（二）侵入,21,（三）生物合成,1.特点：时序性。,早期转录次早期转录晚期基因表达。,以,E.coli,的T偶数双链噬菌体为例。,（三）生物合成,22,早期mRNA,早期蛋白(次早期RNA聚合酶),次早期mRNA,次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶等),晚期mRNA,晚期蛋白(衣壳蛋白、装配酶等),核酸(DNA)复制,宿主细胞RNA聚合酶,dsDNA,次早期DNA,晚期基因,早期mRNA早期蛋白(次早期RNA聚合酶)次早期mRNA次,23,2.,核酸复制,（1）基本规律,双链为半保留，单链先合成互补链，再复制。,（2）病毒DNA或RNA的复制,双链DNA和双链RNA复制（半保留复制）,单链+DNA和+RNA复制,先合成负链，再合成正链。,单链-RNA复制,-RNA,+RNA(即mRNA),-RNA。,逆转录病毒,单链RNA,复制,RNA,DNA,双链DNA,单链RNA。,2.核酸复制,24,（四）、装配,（五）、释放,裂解和出芽。,（四）、装配,25,二、一步生长曲线（,描述烈性噬菌体的复制,）,1.具体操作,敏感菌+噬菌体,（10/1),。,噬菌体抗血清,去除游离噬菌体,。,将培养液高倍稀释,终止抗血清,作用。,定时取样0.5mL+0.5mL,敏感菌悬液,+5mL半固体培养基混匀37培养，12h观察测定噬菌斑数。,绘制一次生长曲线（以,感染时间为横坐标，噬菌斑数为纵坐标）,。,二、一步生长曲线（描述烈性噬菌体的复制）,26,时间,噬菌斑数,潜伏期,裂解期,平稳期,一步生长曲线,2.,三个特征数据：,潜伏期,，,裂解期,和,裂解量,。,裂解量,=,稳定期病毒效价,/,潜伏期病毒效价,时间噬菌斑数潜伏期裂解期平稳期一步生长曲线 2.三个特征数据,27,第四节 非增殖性感染与缺损病毒,侵染后，,不产生有感染性子代病毒粒子,。,一、非增殖性感染的类型,1.流产感染,(abortive infection),2.限制性感染,(restrictive infection),3.潜伏感染,(latent infection),第四节 非增殖性感染与缺损病毒侵染后，不产生有感染性子代病毒,28,1.流产感染,（1）依赖于细胞,非允许细胞,不能复制,(,缺乏复制酶、tRNA或细胞因子),如：人肾细胞允许,人腺病毒；猴肾细胞非允许。,（2）依赖于病毒,病毒基因组不完整（缺损病毒）。,病毒,1.流产感染（1）依赖于细胞非允许细胞不能复制(缺乏复制酶、,29,2.限制性感染,细胞瞬时允许,，病毒不能复制或仅有少数细胞产生病毒。如：人乳头瘤病毒，,感染,各分化期的上皮细胞,，不能晚期转录。,感染,分化成熟的鳞状上皮细胞,晚期转录。,3.潜伏感染,在细胞内，不产病毒，不破坏细胞。,可由病毒基因表达，改变宿主,恶性细胞。,2.限制性感染,30,二、缺损病毒,主要为,基因组有缺陷,，须依赖其他病毒才能复制。,1.干扰缺损病毒(干扰缺损颗粒),(defective interfering particles),DI,颗粒,2.卫星病毒,3.条件缺损病毒,4.整合的病毒基因组,二、缺损病毒,31,1.DI颗粒,复制时产生的,基因缺失突变体,。,各病毒均可产生，在高,感染复数,(m.o.i)时产生频率最高。,m.o.i：每一敏感细胞表面吸附病毒的数量。,m.o.i=1-300,须依赖于同源完全病毒才能复制，但,基因组小，,干扰完全病毒复制,。,1.DI颗粒,32,2.卫星病毒,绝对缺损，,形态结构、抗原性与辅助病毒不同，,少有同源性。,卫星病毒：,E.coli,P,4,噬菌体,(,缺壳体蛋白编码基因,),辅助病毒：,E.coli,P,2,噬菌体,壳体蛋白（合成P,4,噬菌体外壳）,2.卫星病毒卫星病毒：(缺壳体蛋白编码基因)辅助病毒：E.c,33,3.条件缺损病毒,条件致死突变体,，在允许条件,正常增殖；非允许条件,流产感染或死亡。,4.整合的病毒基因组,温和噬菌体,和,肿瘤病毒,。,（1）温和噬菌体（,核酸都是dsDNA,）,有游离噬菌体（游离态）、原噬菌体（,整合态或质粒形式,）和营养噬菌体（营养态）,三种存在形式,。,3.条件缺损病毒,34,（2）溶源菌,特征,溶源性可遗传,可（自发或诱发）裂解,有免疫性,复愈：辐射或氮芥处理，有些菌体会失去原噬菌体。,溶源转变：除免疫性以外获得新性状。,局限转导,（2）溶源菌,35,检出方法,紫外线照射；,将,少量溶源菌和大量敏感菌,混合，倒平板培养，观察。,出现独特噬菌斑,溶源菌。,敏感菌菌苔,溶源菌菌落,透明裂解斑,检出方法敏感菌菌苔溶源菌菌落透明裂解斑,36,（3）肿瘤病毒的整合感染,肿瘤病毒（如乙肝病毒）或RNA病毒，,一定条件下可转入复制循环，产生子代病毒。,DNA病毒：直接整合。,RNA病毒：如逆转录病毒。,（3）肿瘤病毒的整合感染,37,第五节 亚病毒,一、卫星RNA（拟病毒）,单链RNA片段,，在辅助病毒衣壳内，,无单独侵染性。,与辅助病毒,无明显同源性,。,二、类病毒,有单独侵染性,，单链环状RNA。,（其RNA无mRNA活性）,第五节 亚病毒,38,三、朊病毒：独立复制、无免疫性的,疏水性角蛋白。,1982年，美，prusiner发现,1996年诺贝尔奖。,引起的疾病：,疯牛病（牛海绵状脑病）；,羊痒疫（羊搔痒症）；,人的克-雅氏症（老年痴呆症）等。,三、朊病毒：独立复制、无免疫性的疏水性角蛋白。,39,第六节 病毒的可利用价值,1.疾病防治,防治痢疾杆菌、耐药性的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。,2.清除藻类污染,3.,防治害虫和植物病害：多角体、真菌病毒，卫星RNA等。,4.基因工程工具酶：聚合酶、连接酶、核苷酸激酶等。,第六节 病毒的可利用价值1.疾病防治,40,练习题,1.名词：烈性噬菌体、噬菌斑、枯斑、蚀斑、包涵体、致细胞病变效应，噬菌体的效价、一步生长曲线、温和噬菌体、卫星病毒、朊病毒、溶源菌，溶源转变、,感染性核酸、干扰缺损病毒、整合感染、中和作用,。,2.病毒的非增殖性感染有哪几类，引起的原因是什么？,3.一步生长曲线包括哪几个时期，各时期的特点是什么？,4.温和噬菌体的三种存在形式及溶源菌的特性。,5.包涵体有哪些应用？,练习题1.名词：烈性噬菌体、噬菌斑、枯斑、蚀斑、