单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,粘质沙雷氏菌脂多糖的提取,实验目的,1、了解脂多糖,LPS的生理,生化作用及其制,品的应用；,2、掌握从粘质沙,雷氏菌中提出LPS,的主要方法。,实验原理,内毒素endotoxin，ET是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的一类脂多糖物质。机体应用小剂量内毒素，能表达出显著的有益作用，是一种有效的保护性抗原，临床上用于各种恶性肿瘤患者用因放疗、化疗所引起的白细胞减少症，以及由白细胞减少继发的慢性乙型肝炎，多发的急慢性感染等。,脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚8-10nm的类脂多糖类物质。它是革兰氏阴性细菌所特有的结构，是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要组成局部。它还是一种非常重要而被广泛研究的免疫增强剂，同时一些脂多糖是致病性的内毒素。另外在血清分型中脂多糖也有重要作用。,LPS及其类脂A对机体能发挥广泛的生物学作用。LPS一方面可视为革兰氏阴性菌的致病因子，因而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用，另一方面LPS对机体亦可表现出显著的有益作用，如抗肿瘤作用，增强机体特异性抵抗力等。所有的内毒素尽管来源不同，但均具有相似的生理作用。,粘质沙雷氏菌Serratia marcescens曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目，肠杆菌科，沙雷氏菌属。它是细菌中最小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列成短链，每链有36个细胞，能运动，有4条或更多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽孢。,粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界,中分布很广，分布于土壤、水和食,品中，也存在于人的呼吸道、肠道,和粪便中。所以该菌可自土壤、水，,人和动物的粪便中别离得到。,该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发,现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺炎、,泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科,术后创伤感染，是医源性感染的重要条件致,病菌。约半数菌株能产生红色的灵菌素，多,次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失。革兰氏染色呈阴性。,灵菌素,是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖，能激活脑下垂体肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统，抗御病原微生物及病毒的侵袭。同时它还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能。,目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析法、热水提取法和热酚水法。,1三氯乙酸-乙醇冷提法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.25 M三氯乙酸浸提1：3 v/v0 搅拌2 d，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液合并通过0.5 cm高的硅藻土抽滤，得透明的乳白色液体，在36 时参加3.3%体积醋酸钠饱和的乙醇溶液，然后参加68倍体积的冷乙醇，使灵菌素沉淀，沉淀物溶在0.25 M三氯乙酸，按上法反复沉淀3次，透析、冷冻枯燥的灵菌素冻干品。,2盐析法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.2 M三氯乙酸浸提1：3 v/v0 搅拌2天，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液中参加固体硫酸铵使之呈50%饱和度，如有沉淀离心弃去，上清液中加硫酸铵至饱和，室温放置24 h，发生沉淀如不发生沉淀，需参加2倍体积的丙酮：乙醇：乙醚2：2：0.25，离心分成溶剂层和水层，水层继续使用上层溶剂混合物处理23次，直至溶液中乳白色消失为止。收集沉淀，溶于水中，通过强酸和强碱性离子交换树脂除盐，流出液冷冻枯燥，得灵菌素冻干制品。,3热水提取法。菌体用PH 3.5稀醋酸溶液回流提取，提取液用Sevag法除去蛋白质，水层加乙醇，离心收集沉淀，透析，透析液中加NaCl及乙醇，离心别离沉淀得白色粉末粗制品。将它溶于水中，加乙醇一倍体积除去沉淀，再加一倍体积乙醇，收集沉淀，透析，冻干得粘质赛氏甘露聚糖Serratimann。上清液中参加NaCl离心收集沉淀，透析，脱盐，冻干得粘质赛氏杆菌素Serratigen。,4热酚水法。,本次试验所采用的方法，,相比其他三种方法，具有,操作相对简便，提取效果,好的优势。,三、仪器和药品,药品,牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、,琼脂、蒸馏水、生理盐水、,苯酚、无水乙醇,、,NaHCO,3,、,EDTA。,仪器,广泛pH试纸、塑料布、透析袋、。,三角瓶50 mL、250 mL、离心管、玻璃棒、烧杯、可调式移液器1000-1000 L、1-5 mL、,可调式移液器枪头。,恒温培养箱、离心机、,天平、摇床、水浴箱、,冻干机、湿热灭菌锅。,四、实验步骤,菌种培养,斜面培养基培养。,将营养肉汁琼脂培养基g/L：,蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl 5.0，琼脂15.0，PH 值7.0左右制作,成斜面培养基，将菌种接种在斜面培,养基上，28 恒温培养2448 h。,发酵培养基培养。,制作营养肉汁培养基g/L：蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl 5.0，PH值分装于三角瓶中，28 恒温160170 r/min摇床培养2448 h。,热酚水法提取灵菌素,将深层发酵后获得的菌体以10，000 r/min离心20 min，收集菌体。,将菌体悬浮于蒸馏水中,每1g细菌加3ml蒸馏水,进行悬浮，,反复冻融3-5次,效果比较好。,再加热至60，在热细胞悬浮液中参加等体积预热至50 的90%w/w苯酚溶液，,于6872 水浴中,搅拌保温30 min后，,冷至室温。,冰箱中过夜。,然后7，000 r/min离心45 min，取水相。,余下局部再加等量水，按上述方法重复提2次，离心后取水相。,合并水提液，将水相溶液装于透析袋中，流水透析24 h去酚。,再用蒸馏水透析48 h，每天换水数次。,置于冻干机中冷冻枯燥得脂多糖粗制品。,(10)抑菌试验,五、实验结果,根据实验结果计算出LPS的产率。,六、思考题,在细菌悬浮于蒸馏水之后，为什么最好反复冻融3-5次？,制备好的LPS如,果暂时不用，应该,怎样保存？,