,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 抗生素微生物检定技术,第二节 概述,一、抗生素的定义和命名,1、抗生素的定义：抗生素是生物包括微生物、植物、动物在其生命活动过程中产生的或并用化学、生物或生化方法衍生的，能在卑微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。,2、抗生素定义的不断演变过程,1929年Flemming发现了青霉素，1942年链霉素的发现者定义抗生素为：微生物代谢产生的具有抑制它种微生物生长活动甚至杀灭它种微生物的化学物质。,之后随着生物工程技术的不断开展，不断有新的抗生素被发现，而且其来源不仅局限于微生物，植物和动物也能产生抗生素；其作用范围也远远超出了抗菌范围，比方：抗肿瘤细胞的博莱霉素、阿霉素；抗原虫的巴龙霉素；抵抗酶活力的抑胃酶素及抑淀粉酶素等；目前还发现有一些抗生素除抗生作用外，还有其它的作用，如新霉素、两性霉素B等具有降低胆固醇的作用；辛伐他丁、洛伐他丁等有降血脂作用；环孢素有抑制免疫作用可用于器官移植的抗排异反响等。因此，不能把抗生素仅看成是抗菌药物。,2、抗生素的命名：现没有统一的命名方法，根本遵守三条规那么：1动植物或菌类产生的抗生素，根据动物学、植物学或菌属的名称而定。如：青霉素、链霉素、灰黄霉素等；,2抗生素的化学结构或性质已经明确了的可根据其族命名。如：四环素、氯霉素等；,3对一些有纪念意义的或按抗生素产生菌的发现地命名及习惯上已采用俗名的，如：土霉素、平阳霉素等。,二、抗生素的分类,一按来源分：,1、细菌产生的：主要有杆菌肽、多粘菌素等；,2、真菌产生的：主要有青霉素、头孢菌素、灰黄霉素等；,3、放线菌产生的：主要有链霉素、四环素类、红霉素、庆大霉素等。,二按抗生素的作用对象分类：,1、抗革兰氏阳性菌的：如，青霉素、林可霉素、克林霉素、万古霉素、新霉素等；,2、抗革兰氏阴性菌：主要有链霉素、多粘菌素E等；,3、广谱抗生素：如，四环素类、红霉素、氯霉素、卡那霉素、头孢菌素类等；,4、抗真菌类：主要有制霉菌素、灰黄霉素、两性霉素B等；,5、抗肿瘤类：主要有平阳霉素、柔红霉素、放线菌素D、阿霉素等；,6、抗病毒及抗原虫类：主要有抗病毒霉素、曲古霉素、巴龙霉素等；,7、抗结核分枝菌类：主要有链霉素、环丝氨酸、利福霉素等。,三按抗生素化学结构分类：,1、-内酰胺类抗生素：如青霉素类、头孢菌素类及其衍生物。,2、四环素类抗生素：如四环素、土霉素、金霉素及其衍生物。,3、氨基糖苷类抗生素：如链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素等。,4、大环内酯类抗生素：如红霉素、柱晶白霉素、螺旋霉素、罗红霉素、阿霉素等。,5、多烯类抗生素：如制霉菌素、两性霉素B、曲古霉素等。,6、多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽、卷曲霉素等。,7、苯羟基胺类抗生素：如氯霉素、甲砜氯霉素、已酞氯霉素等。,8、蒽环类抗生素：如柔红霉素、阿霉素、紫红霉素等。,9、其他抗生素：如磷霉素、环丝霉素、硫霉素等。,四按作用机制分类：,1、抑制细胞壁合成的：如青霉素、头孢菌素类、万古霉素、杆菌肽和环丝氨酸等。,2、影响细胞膜功能的抗生素：如多粘菌素、制霉菌素、两性霉素B等。,3、抑制和干扰细胞蛋白质合成的抗生素：如四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素庆大霉素、卡那霉素、链霉素，大环内酯类抗生素如红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、氯霉素等。,4、抑制细胞核糖核酸合成的抗生素,5、抑制细菌生物能作用的抗生素,三、抗生素效价标示量,抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。通常用效价来表示。而抗生素效价的标示量，原那么上应按所含特定的抗菌活性局部的重量来计算。但有的是多组分的，有的是按照习惯形成计量单位的。强求一致会影响临床使用量的计算，因此，采取符合客观实际的效价标示方法。,大致分四类：,一“活性重量单位：以抗生素所含特定的抗菌活性局部的重量作为效价单位。如碱性抗生素以纯碱的量作为有效局部的量；酸性抗生素以纯酸的量作为有效局部的量。如阿莫西林钠和阿莫西林三水酸都是以阿莫西林作为活性单位。,二类似重量单位：类似重量单位，其中包括了无效的局部，如：纯粹的金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐。,三重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为1单位而加以折算。如青霉素G钠，以青霉素单位表示其活性单位，其最初定义为：1个青霉素效价单位u为能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌珠发育的最小青霉素剂量。第一批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重0.6g为1u，1667u/mg；第二批1670u/mg。多粘菌素B碱1g指定为10单位。,四特定单位：用于成分复杂的抗生素。如杆菌肽。,四、抗生素微生物检定用标准品,抗生素微生物效价测定用的标准品，是具有一定物理化学性质及一定的生物活性的物质。分为国家标准品或暂行标准品。国家标准品是使用时间较长而又成熟的抗生素，暂行标准品是新的抗生素。国家标准品由中国药品生物制品检定所统一制备管理。,五、抗生素微生物检定法,可分为：稀释法、浊度法、扩散法,管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法1，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。,1.实验器材的准备,1.1 实验器材的选择,试验应该选择底面平整的玻璃双碟，防止底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，参加3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。牛津杯那么应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得牛津杯在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果牛津杯两端不够平，就应予剔除，否那么会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。,1.2 实验器材的清洗,抗生素试验中，玻璃双碟、牛津杯往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素庆大霉素、争光霉素、链霉素等或者被清洗用的杀菌剂如新洁而灭、洗洁精、去污粉等污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160干热灭菌2h后备用。,2.配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基,2.1 样品与标准品溶液的配制,标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于枯燥器内至少30min方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的枯燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，参加超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管23次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。把稀释后的抗生素溶液分装至枯燥灭菌试管待用。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。,2.2 培养基与缓冲液的配制,配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响2。培养基可以购置厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。116湿热灭菌20min后备用。,3.加注培养基,3.1 加注底层培养基,无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的上下浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，到达消除误差的目的。,试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基外表为非水平面，会给试验带来误差。加注6080的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。,3.2 加注培养基菌层,制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50水浴中保温。当参加试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50水浴锅内保温。试验中，再分别参加菌液混匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基温度上升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。,4.放置牛津杯,放置牛津杯时，注意管与管之间不能太靠近，否那么会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置牛津杯，防止放置位置不恰当产生的问题。,牛津杯放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。,5.滴加抗生素溶液,滴加抗生素要按照SHTHSLTL二剂量法或者SHTHSMTMSLTL三剂量法的顺序滴加3。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到牛津杯的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基外表造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应防止太细，滴加的时候离开牛津杯口距离不要太高。滴加中假设有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入牛津杯后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出牛津杯内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与牛津杯管口齐平，液面反光呈黑色。抗生素液体参加量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余局部。,6.双碟中菌株的培养,滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在37下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长那么会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀过于接近热源，会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。,7.抑菌圈测量,7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在1