,Add Your Company Slogan,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Logo,*,实时荧光定量PCR技术RealTime QuantitativePCR,南开大学医学院 lfnn,实时荧光定量PCR技术RealTime Quantitat,1,Logo,RT-qPCR 原理,Contents,1,RT-qPCR 步骤,2,SYBR 实验步骤,3,Logo RT-qPCR 原理Contents1 RT-qP,2,Logo,RT-qPCR 原理,1,定义：,在PCR反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个,PCR扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，最后通过通过Ct值,和标准曲线的分析对,起始模板,进,行,定量分析,的方法,。,1.荧光原理：,SYBR Green,2.定量原理：,（1）,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、Ct值,（2）定量原理：,绝对定量（标准曲线）、相对定量（2,-Ct,）,（3）融解曲线,LogoRT-qPCR 原理1定义：在PCR反应体系中加入荧,3,非特异性荧光标记：,1、SYBR Green,结合于双链DNA小沟之间，,只有和双链DNA结合后才发荧光,。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）,RT-qPCR 原理-荧光原理,非特异性荧光标记：RT-qPCR 原理-荧光原理,4,特异性荧光标记：,1,、TaqMan,水解型杂交探针,。,5端标记有报告基团R,，,3端标记有荧光淬灭基团 Q,。,探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收,，,无荧光,。,Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针R与Q分开，发,出,荧光,。,2,、Molecular Beacon,分子信标。,标记荧光的发夹探针,，,环与目标序列互补,，,茎由互补配对序列组成,。,变性过程：产生非特异性荧光,；,延伸过程：不产生荧光,；,退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,。,3,、Amplisensor,双链信号引物，进行半巢式扩增,；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，,产物量与荧光成反比,。,Q,Q,R,特异性荧光标记：QQR,5,Logo,RT-qPCR 原理-定量原理,1,扩增曲线图：,横坐标：扩增循环数（Cycle）纵坐标：荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,Ct值的定义：,PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,。,Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。,荧光信号阈值（threshold）：,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,。,荧光域值,的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,。,LogoRT-qPCR 原理-定量原理1扩增曲线图：C,6,Logo,RT-qPCR 原理-定量原理,1,理想的PCR反应：,X=X,0,*2,n,非理想的PCR反应：,X=X0(1+Ex)n,n：,扩增反应的循环次数,X：,第n次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex：扩增效率,log,X,0,=-log(1+Ex)*,Ct,+log,X,Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值的循环数即,Ct值,就可计算出样品中所含的模板量,.,1.,绝对定量,LogoRT-qPCR 原理-定量原理1理想的PCR反,7,Logo,RT-qPCR 原理-绝对定量,1,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小,Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,1.,绝对定量,LogoRT-qPCR 原理-绝对定量1 模板DNA,8,Logo,RT-qPCR 原理-绝对定量,1,R,2,为相关系数,：R,2,0.99时，认为两数值之间相关性好。,E为扩增效率,：一般认为在90%-110%之间数据可用。,LogoRT-qPCR 原理-绝对定量1R2为相关系数,9,Logo,RT-qPCR 原理-相对定量,1,2.相对,定量,结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。,LogoRT-qPCR 原理-相对定量12.相对定量结,10,RT-qPCR 原理-融解曲线,温度,荧光强度,Tm,Tm值：,DNA解链一半时的温度,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),融,解曲线为,单一峰,，,无非特异性荧光,，,定量准确,。,溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。,前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。,RT-qPCR 原理-融解曲线温度荧光强度TmTm值：,11,RT-qPCR 步骤-SYBR Green法,1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、Realplex软件,2.将样本等稍许离心,3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）,反应体系：,ddH2O 10L,染料 8L,引物上下游各0.5L,样本 1L,4.将八连管标记后离心至无壁挂液体,5.将其置入Realplex仪中，,设置程序：,95 15s,95 15s,57 30s,74 30s,45循环，END后右键设置“insert-melting curve”，后绿色运行,6、反应结束后将数据导出，分析数据。,RT-qPCR 步骤-SYBR Green法1.准备物,12,反应体系的建立及优化:,SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测,Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准,MgCl,2,（多聚酶的激活剂）,浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物,反应Buffer体系的优化,反应温度和时间参数:由酶和引物决定,其他与常规PCR相同,RT-qPCR 步骤-SYBR Green法,反应体系的建立及优化:RT-qPCR 步骤-SYBR,13,对DNA模板没有选择性,-适用于任何DNA,使用方便,-不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,，,但可以通过,融解曲线的分析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,对DNA模板没有选择性优 点 容易与非特异性双链DNA结,14,Thank you,Thank you,15,