,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,IVF实验室的基本操作,IVF实验室的基本操作,1,实验室操作原则,防止,污染,配子标本的标记；,受精、胚胎移植；,两人核对,毒性测试；,培养液、耗材的使用；,实验室的质量控制和管理,无误,无菌,无毒,实验室操作原则 防止配子标本的标记；毒性测试；无误,2,辅助生殖技术基本操作,配子、胚胎培养系统,1,配子的收集和处理,2,体外受精技术,3,胚胎培养和移植,4,胚胎冷冻和解冻,5,辅助生殖技术基本操作配子、胚胎培养系统1配子的收集和处理2体,3,培养液的准备,培养液的基本组分,无机盐离子,-,维持,pH,和渗透压,碳水化合物,-,能量来源,蛋白质来源,抗生素,矿物油,有利于维持培养液温度、,pH,值和渗透压稳定,防护屏障,减少污染,吸收脂溶性毒素,防止液体蒸发,培养液的准备培养液的基本组分,4,培养液的准备,取卵前一日下午进行,原则:高效、方便、安全、经济,四孔培养皿,卵,处理精液所需培养液,微滴培养,受精卵、胚胎,胚胎移植液,37,5%,或,6%CO2,培箱内 平衡过夜,培养液的准备 取卵前一日下午进行原则:高效、方便、安全、经济,5,卵母细胞的获取,注射,hCG,后,36-38,小时取卵,阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡,核对姓名,解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物,OCCC,37,5,6%CO,2,培养,操作迅速,避光,卵母细胞的获取注射hCG后36-38小时取卵,6,精液处理,正常精液:同,IUI,极度少精:增加离心力,死精症:低渗肿胀实验,附睾穿刺精子:,睾丸穿刺或活检精子:,1ml,注射器针头挑碎组织,离心悬液,附睾、睾丸精子的冷冻,精液处理正常精液:同IUI,7,常规受精,取卵后,4-8h,习惯症:精液正常,轻度少、弱精症,受精率:,65,80,(,MII,卵),受精时间:长受精、短受精,常规受精 取卵后4-8h 习惯症:精液正常,轻,8,实验室的基本操作课件,9,卵母细胞浆内单精子显微注射,习惯症:严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往,IVF,常规受精失败史、某些不明原因不孕等,时间:取卵后,2,小时,剥卵:利用透明质酸酶(,80mIU/ml),和机械法剥除颗粒细胞,卵母细胞浆内单精子显微注射习惯症:严重少弱精、梗阻性无精、畸,10,卵母细胞浆内单精子显微注射,卵母细胞成熟度的评价,GV,MI,MII,卵母细胞浆内单精子显微注射卵母细胞成熟度的评价GVMIMII,11,卵母细胞浆内单精子显微注射,操作滴的准备:,7,PVP,加精,装针,显微注射,受精率:,70,卵母细胞浆内单精子显微注射操作滴的准备:7PVP,12,受精方式的选择,ICSI,的安全性？,逃避了自然选择过程,垂直传递遗传缺陷,操作过程对配子的损伤,严格掌握,ICSI,习惯症,受精方式的选择,13,非男性因素不孕,ICSI,治疗结局,非男性因素不孕症,ICSI,未显现出优势,非男性因素不孕ICSI治疗结局非男性因素不孕症,ICSI未显,14,检查受精,时间:受精后,15,18,小时,机械法除去颗粒细胞及放射冠,正常受精:两个原核,两个极体,检查受精时间:受精后1518小时,15,实验室的基本操作课件,16,实验室的基本操作课件,17,合子形态评价,原核的大小、位置及方向,核仁前体的数目、大小、分布,胞浆的外观,早期卵裂情况,合子形态评价原核的大小、位置及方向,18,异常受精,1PN,发生率,1,5,卵裂率,74%,染色体二倍体率,5,囊胚形成率,29%,(Noyes 2008),机制:,雌雄原核发育不同步,雌雄原核融合,孤雌来源,ICSI,多见,异常受精1PN发生率 15,19,异常受精多,PN,发生率:,IVF 5-8%,ICSI 1%,发生机制:,2,精子进入,第,2,极体滞留,双倍体卵母细胞,异常受精多PN发生率:IVF 5-8%,20,未见原核未受精,估计机制,卵母细胞未成熟,卵母细胞染色体异常,卵裂率,10%,染色体二倍体率,3%,优胚率低,(12/38),囊胚形成,(0/12),(Noyes 2008),未见原核未受精估计机制,21,受精失败,受精率,20%,受精率低下,所有成熟卵均未受精 受精失败,常规受精周期 失败率,10,精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍,补打,ICSI?,ICSI,周期 失败率,2,3,严重精子畸形 卵母细胞激活,钙离子载体？机械激活？,受精失败受精率20%受精率低下,22,胚胎培养,胚胎培养,23,胚胎质量评价,胚胎评价标准,细胞数,碎片,:,无碎片,碎片,50%,卵裂球均匀程度,胚胎质量评价胚胎评价标准,24,囊胚的评分体系,4AA,囊胚腔的大小,内细胞团细胞分级,滋养层分级,三位评分法,1:,不到整个胚胎的一半,2:,超过了胚胎体积的一半,3:,完全占据整个胚胎,4:,扩张囊胚,5:,孵化囊胚,6:,孵化后囊胚,A,包裹紧密,大量细胞,B,结构松散,少量细胞,C,极少量细胞,A,许多细胞紧密结合,B,少量细胞,结构松散,C,极少量细胞,囊胚的评分体系4AA囊胚腔的大小内细胞团细胞分级滋养层分级三,25,2AA,5AA,4BA,4CC,2AA5AA 4BA4CC,26,胚胎移植操作,选择需要移植的胚胎,移入移植滴内,35,岁以下,首次移植的病人移植,2,枚胚胎,35,岁以上,或非首次移植的病人移植,3,枚胚胎,确认核对患者姓名,D3 or D5,移植？,胚胎移植操作选择需要移植的胚胎,移入移植滴内,27,移植液,移植液,移植液和胚胎,气,20,l,气,胚胎移植操作,移植液移植液移植液和胚胎气 20l气胚胎移植操作,28,胚胎冷冻,意义:提高累计妊娠率,幸免多胎,减少卵巢过度刺激风险,温度的急剧变化形成冰晶,机械性损伤 溶质性损伤 渗透压损伤,核心:幸免冰晶形成,冷冻方法:慢冻速融法 玻璃化冷冻法,冷冻保护剂,渗透性保护剂:,EG PRON,甘油,非渗透性保护剂:蔗糖 大分子物质,胚胎冷冻意义:提高累计妊娠率,幸免多胎,减少卵巢过度刺激风险,29,胚胎的冷冻,:,慢速冷冻,室温,15min,室温,5min,室温,15min,PBS,1.5M,丙二醇,1、5M,丙二醇,0、1M,蔗糖,胚胎的冷冻:慢速冷冻室温 15min室温 5min室温15m,30,慢冻速融法,冷冻程序,2,0,7 3/min,-7,人工植冰,-7,30 0、3/min,-30,120 30/min,慢冻速融法,31,胚胎复苏,1,2,3,4,0、5M,丙二醇,0、2M,蔗糖,5min,0、2M,蔗糖,5min,PBS,5min,1、0M,丙二醇,0、2M,蔗糖,5min,预防冰晶的再形成,复苏程序:室温,40s 30,水浴,1min,胚胎复苏12340、5M丙二醇0、2M蔗糖1、0M丙二醇 预,32,胚胎冻融损伤,复苏胚胎评价:,50%,卵裂球完整 存活,复苏率,90%,无损伤胚胎着床率高,部分损伤胚胎着床能力下降,胚胎冻融损伤复苏胚胎评价:50%卵裂球完整 存活,33,玻璃化冷冻,原理,条件:高浓度冷冻保护剂,极快的降温速度,载体:开放式 密闭式,习惯症:卵母细胞 囊胚,优点:复苏率高,玻璃化冷冻原理,34,其他技术,-IVM,未成熟卵母细胞体外成熟(,IVM,),优点:简便 经济 幸免,OHSS,体外培养,24-48h,IVM,培养液,其他技术-IVM未成熟卵母细胞体外成熟(IVM),35,感谢您的聆听！,感谢您的聆听！,36,