单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量,荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量,1,一.实验目的,学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B,2,的分析原理。,掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B,2,的方法。,一.实验目的学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2,2,二.实验原理,荧光分析法,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,在稀溶液中，荧光强度,I,F,与物质的浓度c有以下的关系：,当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：,这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,二.实验原理荧光分析法 常温下，处于基态的分子,3,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。,b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。,c.所需试样量少、操作方法简便。,荧光分析法的特点,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。,4,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。,发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。,固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,荧光光谱,激发光谱,发射光谱,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强,5,荧光分析仪器,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：,a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；,b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,液槽,显示器,单色器,检测器,I,0,I,I,f,光源,单色器,荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单,6,图 RF5301型荧光仪光路图,激发单色器 样品池架 发射光单色器,检测器部分的光电倍增管 荧光部分的光电倍增管,图 RF5301型荧光仪光路图,7,a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。,b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。,c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞,8,维生素B,2,（又叫核黄素，VB,2,）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：,维生素B,2,易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。,维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭,9,维生素B,2,溶液在430440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB,2,的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。维生素B,2,在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB,2,的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,多维葡萄糖中含有维生素B,1,、B,2,、C、D,2,及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B,1,本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D,2,用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B,2,的测定。,维生素B2溶液在430440 nm蓝光的照,10,实验预习,预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B,2,的分析原理。,了解荧光光度计的操作步骤和测定多维葡萄糖粉中维生素B,2,的方法。,实验预习预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析,11,RF5301型,荧光光度计（日本岛津）,5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只，50 mL容量瓶7只,10.0gmL,-1,VB,2,标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），,多维葡萄糖粉试样,三.仪器与试剂,RF5301型荧光光度计（日本岛津）三.仪器与试剂,12,1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。,2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长=440 nm，发射波长=540 nm。,3.样品测定。,4.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。,基本操作,1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化,13,1.,标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定,：,在六个干净的50 mL容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00 mL VB,2,标准溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。,2.,未知试样的测定:,称取0.15-0.20 g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。,四.实验步骤,1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：四.实验步,14,1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。,2.根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB,2,含量。,五.数据处理,1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。五.数据处,15,试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。,维生素B,2,在pH67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？,六.注意事项和问题,试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。六.注意事项和问,16,