单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SSR,分析的原理及操作技术,DNA,分子标记技术类型,以,Southern,杂交为基础的分子标记技术：,限制性内切酶片段长度多态性标记（,RFLP,）,以,PCR,为基础的分子标记技术：,随机引物,PCR,标记,和,特异引物,PCR,标记,随机扩增多态性,DNA,（,RAPD,）,扩增的限制性内切酶片段长度多态性（,AFLP,）,相关序列扩增多态性（,SRAP,）,简单重复序列（,SSR,）或简单序列长度多态性（,SSLP,）,以,mRNA,为基础的分子标记技术：,差异显示（,DD,）,逆转录,PCR,（,RT,PCR,）,以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：,单核苷酸多态性（,SNP,）,SSR,简介,在,生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复,序列，,根据重复序列在基因组中的分布形式可分为,：,串联重复序列,（,Tandemly repeated sequences,）,分散重复序列（,Interspersed repeated sequences,）,依据重复基序的,长度,、,拷贝数,和,位置,等又将串联 重复序列分为：,卫星,DNA,：基序（,motif,）长,10,300bp,，甚至长,1,000,100,000bp,；,小卫星,DNA,：基序长,10,60bp,；,微卫星,DNA,：基序长,1,6bp,，其,功能,：,重组热点、对基因的调节和表达以及性别决定等。,SSR,简介,微卫星,DNA,即,简单重复序列,（,simple sequence repeat,，,SSR,），,或者,微卫星序列,（,microsatellite,，,MS,），,又称,短串联重复,（,short tandem repeats,，,STR,），,是一类由几个核苷酸（多为,2,4,个）为,基本,单位,多次串联重复而,形,成的,DNA,片段,，其长度一般较短，,多,在,200bp,以内。,微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物,基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但,（,AT,）,n,最多。,SSR,标记的基本原理,尽管微卫星,DNA,分布于整个基因组中的不同位置，但某一特定的微卫星的两端,侧翼序列,通常都是,保守性较强的,单一,序列,，,将重复序列及其两侧的,DNA,片段进行,克隆,和,测序,，然后根据两端的侧翼序列,设计一对特异引物,，通过,PCR,技术将,目的,微卫星,DNA,片段,扩增出来,。,SSR,标记的基本原理,由于单个微卫星位点,的,重复单元在数量上的不同,，导致扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这,种,多态性称为,简单序列长度多态性,(,simple sequence length polymorphism,，,SSLP,),，每一扩增位点就代表了该位点的一对等位基因。,SSR,标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，,SSR,具有大量的等位差异，多态性十分丰富。,PCR,技术的基本原理,聚合酶链式反应（,polymerase chain reaction,，,PCR,）是利用单链寡核苷酸引物对特异,DNA,片段进行体外快速扩增的一种方法。,特点一：,使,特定的,DNA,片段得到,了迅速大量的扩增，理论上的最高值达,2,n-2,；,特点二：能够,指导,特定,DNA,片段,的合成。,如何实现？,PCR,反应体系,一对特异引物：,1.,引物长度,：典型的引物长度为,18-24,bp,，引物需要足够,长,，保证序列独特性。但是长度大于,24,bp,的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；,2.,引物浓度,：一般,0.1-0.5,mol/L,，过高的引物浓度会加剧错配发生，特异性下降；,3.,合理的,G/C,含量,：一般为,40,60,。,PCR,反应体系,Mg,2,溶液,：其浓度直接影响引物,退火的特异性,、,产物特异性,以及,酶的催化能力和准确性,等，适当降低,Mg,2,浓度可增加特异性,。,模板,DNA,：一般,1ng/1L,，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；,dNTP,：常用浓度为,50-200,mol/L,，种,dNTP,浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。,Taq,酶：,DNA,聚合酶，热稳定，最适温度,72,，酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,10,buffer,缓冲液（不含,Mg,2,）：,维持,PCR,pH,的稳定。,PCR,循环条件,高温变性：双链,DNA,模板加热变性成单链；,低温退火,：在低温下引物与单链,DNA,互补配对,；,退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特异扩增，,而,退火温度过高，,又,难以扩增出条带，对于长度为,20bp,，,GC,含量为,50,的核苷酸的典型引物，,55,是比较适宜的退火温度。,适温延伸：在适宜温度下,Taq DNA,酶催化引物沿着模板,DNA,延伸。,PCR,条件优化,优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设计引物。,热启动技术：在,PCR,反应的第一个循环中待温度升高且超过模板,Tm,值（,80,）后，,再,加入关键试剂如,Taq DNA,聚合酶等。这样操作可以减少非特异性扩增。,创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如,降低,Mg,2,，,dNTP,浓度,，,优化,pH,及,减少,Taq,酶的用量,，,减少循环中各部分的时间或循环数,，,提高退火温度,等。,电泳原理,在生理条件下，核酸分子之糖磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。当核酸分子被放置在电场中时，他们就会向,正电极,的方向迁移。,在一定的电场强度下，,DNA,分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的,DNA,分子，比分子量较大的,DNA,分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率较快。,电泳介质,琼脂糖,凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,优点：,分辨率极高,，可分开长度仅相差,0.1,的,DNA,分子，即,1000bp,中相差,1bp,；,从聚丙烯酰胺凝胶中,回收的,DNA,纯度很高,，可用于要求最高的实验。,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶是由,丙烯酰胺,单体，在催化剂,TEMED,(N,N,N,N,一四甲基乙二胺,),和,过硫酸铵,的作用下，聚合形成线状长链，在交联剂如,N,N-,甲叉双丙烯酰胺,参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶,。,这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度,。,聚丙烯酰胺凝胶,变性聚丙烯酰胺凝胶,用于,单链,DNA,片断的分离与纯化。这些凝胶在,尿素,或,甲酰胺,等,抑制核酸碱基配对,的试剂的存在下发生聚合。变性的,DNA,在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。,非变性聚丙烯酰胺凝胶,用于,双链,DNA,片段的,分离和纯化。双链,DNA,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条,DNA,的迁移率可相差,10,。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于,制备高纯度的,DNA,片段,和,检测蛋白质,DNA,复合物,。,用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常,PCR,产物在,变性聚丙烯酰胺凝胶,上分离效果,优,于,非变性胶。因为杂合个体在,PCR,后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了,3,条带甚至是,4,条带，,而,不是正常的,2,条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。,染色方法与原理,溴化乙锭（,EB,）染色,法：,但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭的荧光有,猝灭,作用，,EB,染色法很难检测到少于,10ng,的,DNA,条带,。,银染法,（硝酸银）,：,是一种检测微量,DNA,的理想方法。,优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永久保存,原理：,银染液中的,银离子,(Ag+),可与,DNA,形成稳定的复合物，然后用还原剂如,甲醛,在,碱性条件,下使,Ag+,还原成银颗粒，可把,DNA,电泳带染色成黑褐色,载样缓冲液（,loading,buffer,）,指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖,400,等组成载样缓冲液，加入到扩增好的,PCR,产物当中。,作用,：,1.,增加样品密度，使其比重增加，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内。,2.,形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。,3.,使样品呈色，使加样操作更方便。,实验方法与步骤,1.,实验材料,马贵荔,（母本）,焦核三月红,（父本）,F1,杂种群体中部分个体的基因组,DNA,溶液。每人做,4,个模板,。,一对特异引物：,B-F09 F,：,5,TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3,B-F09 R,：,5,CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3,2.,配制,SSR,扩增的反应液：,各组份的用量及终浓度如下表，,做多个反应,时,，可将所用的的相同组份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。,组分,1,个反应体积,终浓度,4,个反应体积,ddH,2,O,10.2,L,40.8,L,10,buffer,缓冲液,（含,15mM Mg,）,2.0,L,1,8,L,2.5mM dNTP,1.6,L,0.2mM,6.4,L,5,M,引物,F,1.0,L,0.25,M,4,L,5,M,引物,R,1.0,L,0.25,M,4,L,模板,DNA,（,5ng/,L,）,4,L,1ng/,L,Taq,酶（,5U/,L,）,0.2,L,1U,0.8,L,总体积,20,L,80,L,3.SSR-PCR,配制好反应液后，放入,PCR,仪中进行扩增反应，扩增程序为：,94,3min,（预变性）；,94,50s,55,50s,72,50s,（,35,个循环）；,72,10min,（延伸反应）,4.,制备,5,的变性聚丙烯酰胺凝胶：,将,长、短,玻璃板固定在制胶板上，用,1.0,的琼脂糖封口,，,将配好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，静置,1h,，让其聚合凝固。,5,变性胶,100ml,尿素（,Urea,）,42g,5,TBE buffer,20ml,40,丙稀酰胺,12.5ml,10,过硫酸铵,400,l,TEMED,87.5,l,40,丙稀酰胺溶液（,19,：,1,）,100ml,丙稀酰胺（,Acrylamide,）,38g,甲义,-,丙稀酰胺（,Bis-Acrylamide,）,2g,5.,电泳样品的准备：,在,PCR,产物中加入,8,L,的,loading,buffer,混合，,得到混合物，,95,加热,3min,，迅速置于冰上冷却,，然后,点样。,6.,电泳：,每个点样孔中，点加适量的混合物（,4,L,），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加,DNA Marker,（分子量标记物），以便计算分子量，以,300V,电压进行恒压电泳，,电泳液为,0.5,TBE,，,待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳,。,Loadingbuffer,组分,用量,98,Formamide,（甲酰胺）,49ml,（,100,）,10MmEDTA,（,pH8.0,）,1ml,（,0.5M,，,pH8.0,）,0.25,Bromophenol Blue,（溴酚蓝）,0.125g,7.,染色,步骤,试剂,漂洗,30s,ddH,2,O,染色,8min,0.1,硝酸银,400ml,漂洗,30s,ddH,2,O,显色,4min,8g NaOH,，,2ml 37,甲醛，,0.1g,四硼酸钠定容至,500ml,漂洗,ddH,2,O,8.,观察,记录,父母本及,F1,代的带型，供进一步的分析用。,