单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分析化学,第十一章 荧光分析法,分析化学教研室,1,分析化学第十一章 荧光分析法1,荧光分析法,（,Fluorometry,),概 述,荧光定量分析方法,荧光分析技术与应用,基本原理,小 结,2,荧光分析法（Fluorometry)概 述荧光定量分析方法荧,11.1,概述,水溶性荧光黄,无辐射跃迁,放出热能或动能,物质基态,光照射,激发态,光致发光,发射荧光和磷光,物质基态,吸收,特定光,荧光分析法：,基于对化合物的荧光测量建立起来的分析方法,荧光测量包括：荧光谱线位置及荧光强度,3,11.1 概述水溶性荧光黄无辐射跃迁物质基态光照射激发态光致,续前,荧光,可见紫外,相同点,分子光谱,分子光谱,不同点,本质,发射光谱,吸收光谱,灵敏度,10,-8,10,-10,g/ml,10,-5,10,-7,g/ml,选择性,高,一般,荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较,激发光源,荧光分析法,紫外可见光,分子荧光法,（,Molecular Fluorometry),X,射线,X,射线荧光法（,X-ray Fluorometry),原子特征谱线,原子荧光法（,Atomic Fluorometry),荧光分析法分类：,根据光源不同进行分类,返回,4,续前荧光可见紫外相同点分子光谱分子光谱不同点本质发射光谱吸收,11.2,基本原理,11.2.1,分子荧光光谱的产生,11.2.2,激发光谱与发射光谱,11.2.3,分子结构与荧光的关系,11.2.4,影响荧光强度的外部因素,5,11.2 基本原理 11.2.1 分子荧光光谱的产生5,11.2.1,分子荧光光谱的产生,一、分子能级与电子能级的多重性,单重态：,singlet state,三重态：,triplet state,分子的能级包括：电子能级（,10ev,）、振动能级,(0.1ev),及转动能级,(0.001ev),电子能级的多重性,M:M=2S+1,；,S,为总自旋量子数,6,11.2.1 分子荧光光谱的产生一、分子能级与电子能级的多重,续前,A B C,单重态和三重态电子分布,能 量,*,*,*,A,：,基态单重态,B,：激发单重态,C,：激发三重态,激发三重态,T,激发单重态,S*,基态单重态,S,0,7,续前A B,跃迁类型的比较,续前,跃迁类型,基态激发单重态,S,*,基态激发三重态,T,*,所需能量,大,小,自旋方向,不变,改变,跃迁几率,接近于,1,10,6,（光学禁阻）,8,跃迁类型的比较续前跃迁类型基态激发单重态S*基态激发三重,二、荧光的产生,续前,处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：,辐射跃迁,荧光,磷光,回基态途径,内部能量转换,体系间跨越,振动弛豫,外部能量转换,无辐射跃迁,1 2 3 6 4 5,9,二、荧光的产生续前处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径,1,、振动弛豫,（,vibrational relexation,）,续前,过程,：,从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式，,回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫,特点：,发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时,间约,10,-12,秒。,或,返回,10,1、振动弛豫（vibrational relexation）,2,、,内部能量转换,（,internal conversion),续前,过程,：,当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠,时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低,电子能级，这种过程称为内部能量转换,特点：,发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有,重叠；时间约,10,-1,10,-13,秒。,或,11,2、内部能量转换（internal conversion)续,续前,处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量,转换，均回到第一激发态的最低振动能级,过程：,振动弛豫内部能量交换振动弛豫,返回,注：,12,续前处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量返回注：12,3,、体系间跨越,（,intersystem crossing),续前,过程,：,处于激发态的电子自旋方向发生改变，而使电子能级的,多重性发生变化的过程,特点：,激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间,的跨越（,S,1,*T,1,）。,结果：,这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。,13,3、体系间跨越（intersystem crossing)续,续前,影响体系间跨越几率增大的因素：,含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。,在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体,系间跨越的发生几率。,原因：,高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运,动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反,转的发生。,返回,14,续前影响体系间跨越几率增大的因素：含重原子的分子（如碘、溴等,4,、荧光,（,fluorescence,）,续前,过程,：,电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的,任一振动能级而发射的光量子为荧光,特点：,发生在激发单重态最低振动能级与基态之间。时间约为,10,-7,10,-9,s,。,注：,发射荧光的能量比吸收的能量小,1,0,即发射波长,激发波长,15,4、荧光（fluorescence）续前过程：电子由单重态的,硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱,激发光谱,荧光光谱,激发光谱,荧光光谱,返回,16,硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱激发光谱荧光光谱激发光谱荧光光谱,5,、磷光,（,phosporescence,）,续前,过程,：,电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的,任一振动能级而发射的光量子为磷光,特点：,发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三,重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约,为,10,-4,10 s,。,注：,发射磷光的能量比荧光的能量小,2,1,0,即磷光波长,荧光波长,激发波长,17,5、磷光（phosporescence）续前过程：电子由三重,续前,荧光与磷光的比较,荧 光,磷 光,跃迁,激发单重态,最低振动能级基态,激发三重态,最低振动能级基态,光电子能量,E,激发,E,荧光,E,磷光,波长,激发,荧光,磷光,发射时间,10,-9,10,-7,秒,10,-4,10,秒,返回,18,续前荧光与磷光的比较荧 光磷 光跃迁激发单重态激,6,、,外部能量转换,（,external conversion),续前,过程,：,如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂,之间会发生碰撞而失去能量，,这种非辐射跃迁的过程称,为外部能量转换,特点：,发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约,为,10,-7,10,-9,秒。,结果：,导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭,或,19,6、外部能量转换（external conversion)续,续前,返回,返回,2,20,续前返回返回220,11.2.2,激发光谱与发射（荧光）光谱,激发波长,发射波长,荧光物质分子的两个特征光谱,激发光谱,(excitation spectrum),：,F,ex,荧光光谱,(fluorescence spectrum),：,F,em,21,11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长发射波长,（二）激发光谱与荧光光谱,激发光谱,：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起,物质发射某一波长荧光所得的光谱。,方法：固定发射光波长,em,，依次改变激发波长,ex,，测,荧光强度,F,，以,F-,ex,作图得荧光物质的激发光谱。,发射光谱,：（荧光光谱）固定激发光波长,ex,，依次改变发射,波长,em,，测荧光强度,F,，以,F-em,作图得荧光光谱。,激发光谱与荧光光谱上的,max,是定性定量的依据,22,（二）激发光谱与荧光光谱激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同,荧光光谱的特点,（重点）,（,1,）,斯托克斯位移：,荧光发射,波长,总是大于,激发,波长。,原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换等,（,2,）,荧光发射光谱的形状与激发波长无关,原因：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产,生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能,级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光,(,如图,),。,（,3,）,荧光发射光谱与激发光谱的,镜像关系,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一,样）成镜像对称关系。,23,荧光光谱的特点（重点）（1）斯托克斯位移：荧光发射波长总是大,蒽的激发光谱和荧光光谱,S,0,S,1,*,=4,=3,=2,=1,=0,=4,=3,=2,=1,=0,b,4,b,3,b,2,b,1,b,0,c,0,c,1,c,2,c,3,c,4,E,4,E,3,E,2,E,1,E,4,E,3,E,2,E,1,蒽的能级跃迁图,镜像关系的原因,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似,返回,24,蒽的激发光谱和荧光光谱S0S1*=4=3=2=1,11.2.3,分子结构与荧光的关系,1.,分子产生荧光必须具备的条件,（,1,）,具有合适的结构：,结构中有共轭,*,产生的,K,带，,能吸收紫外,-,可见光,（,2,）,具有一定的荧光效率（,）：,荧光效率（,）：,荧光效率只能为,0,1,荧光效率低的物质可能有强的紫外吸收，但所吸收的能量,以无辐射跃迁的方式释放，不出现荧光发射；,25,11.2.3 分子结构与荧光的关系 1.分子产生荧光必须具备,2.,分子结构对荧光的关系,（,1,）跃迁类型：,*是强吸收带，电子跃迁几率大，荧光效率高；,n,*,是弱吸收带，电子跃迁几率小，产生的荧光极弱；,（,2,）,共轭效应,：,提高,*共轭度，有利于增加荧光效率，并产生红移,（,3,）,刚性共平面结构：,刚性共平面结构，电子共轭性增加，荧光强度增大。,（,4,）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。,给电子基团引入，,（,-NH,2,，,-OH,，,-OCH,3,等），增加共轭程度,吸电子基团引入，,（,-COOH,，,-NO,2,，,-Cl,等），减弱共轭程度,影响不大：,-SO,3,H,，,-NH,3,+,，,-R,，对共轭体系作用较小,返回,26,2.分子结构对荧光的关系（1）跃迁类型：（4）取代基效应：,续前,苯,萘,蒽,ex=205nm,em=278nm,f=0.11,286nm,321nm,0.29,356nm,404nm,0.36,联苯,f,=0.2,芴,f,=1.0,返回,27,续前苯萘蒽ex=205nm286nm356nm联苯f=0,1,、温度：低温，,f,。,原因：温度,T,，分子运动加快，磁撞几率无辐射跃迁,2,、溶剂：,溶剂介电常数，极性，,n,*,E,f,，,*,E,f,，,溶剂含重原子或溶解氧（,CBr,4,等,),，体系间跨越。,使,f,，甚至熄灭。,溶剂粘度,，,f,，,F,11.2.4,影响荧光强度的外界因素,28,1、温度：低温，f。11.2.4 影响荧光强度的外界,续前,3,、,pH,影响,对酸碱化合物，溶液,pH,的影响较大，需要严格控制；,4,、荧光熄灭的影响,荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂,常见的熄灭剂有：,卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化,合物、重氮化合物、羰基化合物。,给电子基团,29,续前3、pH影响给电子基团29,续前,5,、散射光的干扰,散射光,:,当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，,小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方,向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。,瑞利光,:,光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方,向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射