单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床检验中的发光免疫分析,原理、优势和值得注意的问题,北京大学医学部研究员,中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员,国际生物发光和化学发光学会,(ISBC,）,学术理事,Council member of scientific advisory board of,International Society on Bioluminescence&Chemiluminescence,杨晓林,由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。,与荧光最大的区别在于无需激发光,，因此后者也被称为光致发光。,发光（,Luminescence,）,化学发光,（,Chemiluminescence,）生物发光（,Bioluminescence,）,生物发光和化学发光均属于,冷光,，即发光不是由于发光体温度升高所致，因此其,反应能量绝大部分用于发光,而不是发热，发射波长也与温度无关。,发光测定属发射光谱分析，多采用动力,/,速率法或积分法，,无需终止反应，也不,受,朗伯,-,比尔定律限制,；,而酶标显色测定,属吸收光谱分析，多采用终点法，,需终止反应，并受,朗伯,-,比尔定律限制,。,按化学反应类型,化学发光的分类,酶促化学发光：,辣根过氧化物酶系统,碱性磷酸酶系统,黄嘌呤氧化酶系统,非酶促化学发光：,吖啶酯系统,草酸酯系统,三价铁,-,鲁米诺系统,闪光（,Flash,）,:,按发光持续时间,发光时间在数十分钟以上，如：,HRP-,Luminol,系统,AP-AMPPD,系统,黄嘌呤氧化酶系统,无须原位进样、以速率法测量。,发光时间在数秒内，如吖啶酯,以原位进样,(In Situ Injector),和时间积分法测量,辉光（,Glow,）,:,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光与辉光及其测量方式的差别,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统,H,2,O,2,+,NH,2,O,O,NH,NH,N,2,OH,-,HRP,NH,2,CO,2,-,CO,2,-,+Photon(425nm),R,OH,R,OH,N,S,R,B,OH,OH,增强剂,（,Enhancer,）,商业化产品中常见的化学发光系统（一）,AMPPD,及其衍生物的化学发光系统,+,*,光子,(477nm),AP,O,O,OCH,3,OPO,3,2-,O,-,O,O,OCH,3,O,O,-,O,OCH,3,商业化产品中常见的化学发光系统（二）,CH,3,C=O,O,R,N,+,OH,-,H,+,H,2,O,2,+H,2,O,+,R,OH,光子,+CO,2,+,CH,3,C=O,O,R,N,HO,CH,3,C=O,O,R,N,HOO,CH,3,O,N,CH,3,O,N,C=O,O,商业化产品中常见的化学发光系统（三）,吖啶酯化学发光系统,发光检测的剂量,-,反应关系曲线,信号强度（,Y,）,实际曲线,标记物浓度（,X,）,理论,/,校正曲线,由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线,因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键,发光信号检测,光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（,CCD,）,结构简单、性能稳定,但灵敏度低、线性范围较窄。,主要特点,原理：,光信号,光电转换器件,电压或电流信号,放大,单光子计数器是目前高灵敏度,发光分析仪的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品,产生光子,激发光阴极,产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位,数字脉冲,(RLU),在各打拿极之间得到,能量和数目的倍增,单光子计数器的工作特性,光子计数（,Y,）,发光强度（,X,）,饱和点,理论,/,校正曲线,实际计数曲线,由于：单光子计数是在检测随机光子事件,因此：随光子数量增多检测效率持续下降,所以：准确的校正技术是设备品质的关键,模拟（光电流）测量曲线,单光子计数式发光检测仪,计,算,机,打,印,机,发光仪控制模块,发光仪执行模块,控制器,程控高压,计数,/,贮存器,单光子计数器,样品运动,/,定位装置,程控自动门锁及检测装置,原位注射泵,光生物学技术的应用范围,军事侦测,公安稽查,卫生检疫,药物筛查,医学诊断,环境检测,航天遥感,生命科学,已成为现代生物技术最活跃的领域之一,光生物学检测技术的优越性,彻底消除了放射性危害,无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长,容易实现连续、动态、重复测定,适合于复合标记系统进行多指标并行测定,操作简单，反应速度快，容易实现自动化,灵敏度和线性范围超过以往技术,几种标记,/,检测技术理论极限灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度,(mol/L),10,-18,10,-15,10,-12,10,-9,几种标记,/,检测技术理论线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,10,5,10,4,10,3,10,2,几种标记,/,检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,18,15,12,9,6,3,0,0,20,000,40,000,60,000,80,000,100,000,试剂盒,仪器,特殊防护,治理污染,人民币,人民币,三种免疫测定技术的成本及费用,三种免疫测定技术的成本及费用,放免,酶标,发光,夹心法的剂量,-,反应关系曲线,信号强度（,Y,）,线性范围,待测物浓度（,X,）,Hook(,前滞,),效应,分析灵敏度（最低检测限）（,95%,可信度）：,S0,+,2SD,在该曲线上所对应的浓度值。,功能灵敏度：,测定误差（变异）,20%,的最低可检测浓度。,线性范围：,（分析）,功能灵敏度,-,变异,20%,的最高检测浓度,相关系数,0.99,的曲线范围,竞争法的剂量,-,反应关系曲线,待测物浓度（,X,）,信号强度（,Y,）,线性范围,分析灵敏度（最低检测限）（,95%,可信度）：,S0-2SD,在该曲线上所对应的浓度值,功能灵敏度：,测定误差（变异）,20%,的最低可检测浓度,线性范围：,（分析）,功能灵敏度,-,变异,20%,的最高检测浓度,相关系数,0.99,的曲线范围,发光免疫分析技术,的现状及应注意的问题,商品化光生物学标记检测技术性能比较,技术类型,标记、反应体系,主要优点,主要不足,化,学,发,光,酶促,过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂等,测量方式简单（速率法）成本较低、灵敏度较高,工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移,螺旋金刚烷环氧化物、碱性磷酸酶,测量方式简单（速率法）灵敏度较高,非酶促,吖啶酯、过氧化氢,灵敏度较高,试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积分法）需原位进样,(In Situ Injector),仪器成本及维护费用较高试剂成本较高,时间分辨荧光,铕（,Eu,）、镝,(,Dy,),、,钐（,Sm,）、,铽（,Tb,）、,等络合物脉冲光源激发,灵敏度较高、试剂较稳定,测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中同类元素可导致本底干扰,电化学发光,钌,(,Ru,),的络合物脉冲电场激发,化学发光：,Chemiluminescence,时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）,Time Resolved Fluorescence,（,Time Delayed Photoluminescence,）,标记物为稀土元素络合物，通常采用解离增强荧光免疫分析（,DEFIA,）,电化学发光（也称场致发光）,Electrochemiluminescence,（,Electroluminescence,）标记物为稀土元素络合物,例如：电化学发光,TSH,检测试剂的分析灵敏度为,0.005mIU/L,第四代化学发光,TSH,检测试剂的分析灵敏度为,0.001mIU/L,原因在于抗体的亲合力，而不是检测技术。,抗体筛选、干扰屏蔽，生产工艺、管理水平和技术服务是决定产品性能的关键,某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反应的理论极限,10,-19,mol/L,即：六个待测物分子,/100ul,样品,就发光分析而言，制约灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰因素，而不是检测技术。,所以，片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的。,商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区,C,肽,胰,岛,素,免疫源性胰岛素,胰,岛,素,胰岛素原,真胰岛素,胰岛素,针对掩蔽性抗原,抗体选择,胰岛素,多抗或无选择性单抗,亚,单,位,亚,单,位,亚,单,位,普通,HCG,亚,单,位,HCG,亚,单,位,亚,单,位,HCG,游离亚单位,亚,单,位,X,抗体选择,HCG,(TSH,、,PRL,、,LH,、,FSH,类似,),多抗或无选择性单抗,针对掩蔽性抗原,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,结合蛋白,PSA,总PSA,PSA,游离,PSA,抗体选择,游离,PSA,针对掩蔽性抗原,针对非掩蔽性抗原,与结合和游离,PSA,等分子结合,小分子性激素测定方法的进展,减少,结合蛋白,类似物,前体,代谢产物,干扰,直接测定法,经典方法,消化样品,萃取有机相,分子筛柱分离各类甾体,测定,血清直接测定,+,高特异性单抗,+,结合蛋白屏蔽技术,男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径，其结构也非常相似；而且普遍与血清中的某些蛋白结合。,因此，皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、血清蛋白异常、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常。,游离甲状腺激素测定方法的进展,常见甲功指标：,TSH,、,FT,3,、,FT,4,、,TT,3,、,TT,4,对甲亢的诊断价值依次为：,TSH=FT,3,FT,4,TT,3,TT,4,对甲低的诊断价值依次为：,FT,4,=TSH,TT,4,FT,3,TT,3,但,FT,3,、,FT,4,灵敏度要求高，且易受干扰,发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过,TT,4,和,TT,3,两步法,操作时间长,灵敏度差,准确性差,类似物法,操作时间短,灵敏度较好,准确性较好,反向竞争法,（标记抗体）,操作时间短,灵敏度更好,准确性更好,第一代（放免）,第二代,第三代,血清,FT,3,、,FT,4,试剂盒的发展,（,消除结合蛋白对测定的影响,）,测定游离激素的参考方法（“金”标准）：平衡透析法（透析液过多可导致测值偏高）,操作复杂、采样量大，不适于临床常规,游离激素测定法的试金石,稀释实验,以游离,T,4,为例,样品稀释,20,倍以内测值无明显变化,（应扣除实验本身对样品的稀释度并注意基质效应,建议用,6-8%BSA,稀释）,FT,4,+TBG,K,T,4,TBG,游离,T,4,游离结合蛋白,结合常数,结合,T,4,其中：,K=,由于绝大部分,T,4,呈结合状态，因此：,T,4,TBGTT,4,(,总,T,4,);TBG,总,TBG,TT,4,故，,K,所以，样品被稀释,N,倍后，,T,4,TBG,FT,4,TBG,TT,4,FT,4,(,总,TBG,TT,4,),(,固定常数，不变,),TT,4,K,(,总,TBG,TT,4,),TT,4,/N,K,(,总,TBG,/N,TT,4,/N,),FT,4,=,TT,4,/N,K,(,总,TBG,TT,4,),/N,=,TT,4,K,(,总,TBG,TT,4,),相 同,即，,FT,4,发光技术,临床免疫分析划时代的进步,以,TSH(,促甲状腺素,),为例,第一代,TSH,检测试剂盒,普通放免,功能灵敏度,1-2mIU/L,基本无法测到正常值,下限以下的血清,TSH,对甲亢的诊断意义不大,固相放免,功能灵敏度,0.1-0.2mIU/L,在甲亢的诊断中,开始发挥作用,第二代,TSH,检测试剂盒,发光免疫,功能灵敏度,0.01-0.02mIU/L,成为甲亢诊断的,首选指标之一,新型发光免疫,功能灵敏度,0.001-0.002mIU/L,更新了部分临