,单击此处编辑母版标题样式,*,免疫学实验,免疫学实验,1,实验一、外周血单个核细胞的分离,单个核细胞：,一、基本原理,?常用哪些方法分离细胞，免疫学可采用哪些方法,本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质，通过速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞。,二、操作：,1、稀释血：1ml血+1ml缓冲液（含510IU/ml肝素的PBS，无血清）（用滴管）,实验一、外周血单个核细胞的分离 单个核细胞：,2,离心,单个核细胞,（斜面！）,2,、加于淋巴细胞分离液上层，离心：,500g 20min,（小于,1000rpm),！沿管壁滴加,!,淋巴细胞分离液取法,3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（12倍量含5IU/ml肝素、2灭活小牛血清的PBS液），离心：200g 10min，除去血小板。,4、洗涤：同样营养液洗涤2次，洗去淋巴细胞分离液，离心：500g 10min,离心单个核细胞2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 2,3,5,、检查细胞存活率：,（,1,）将,1,滴细胞悬液和,1,滴台盼兰混匀，静置,5-10,分钟。,（,2,）上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细胞，计数活细胞数和死细胞数。,三、注意事项：,1,。血液制品,2,。注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在细胞分离液上，避免破坏其界面。,3,。在收集单个核细胞时，预先将毛细滴管中的气体排空，再将毛细滴管轻轻插入单个核细胞层，沿管壁轻轻旋转吸取细胞，千万不能吹打，以免影响细胞的收集效果。,5、检查细胞存活率：,4,4,。抽血后在,2,小时内使用。,*关于实验报告：,全部内容都要填写，关于日期。,报告你的细胞收率，存活率。,4。抽血后在2小时内使用。,5,实验二、酶联免疫检测技术（ELISA）,一、实验原理：,酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分灵敏的、能够定量进行的抗原抗体结合反应与高催化效能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来测定抗体外，原则上适用于一切可以诱导动物产生相应抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强，灵敏度高，操作简便，无须特殊设备，特别适用于测定成分复杂的体液及组织中的微量生命物质，而且几乎不受其他物质的干扰。,实验二、酶联免疫检测技术（ELISA）一、实验原理：,6,一、原理（续）,测定方法：,酶联免疫测定法应用非常广泛。具体操作方法随测定对象及测定要求的不同而有很大差异。,液相固相吸附测定法酶联免疫吸附测定法(ELISA)简称酶标法。,酶标法的基本测定方法有三类：,即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体)双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体)抗原竞争法。,一、原理（续）测定方法：,7,本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。,本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。,8,二、实验方法：,1、包被抗体：包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的,碳,酸盐缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔,18孔的安排：,套上包装袋，4过夜，弃上清，以洗涤液(200ul)洗涤三次，甩干。,关于对照、平行！,标准：,S1-S5,ELISA,荧光免疫,空白对照,阴性对照,阳性对照,二、实验方法：1、包被抗体：包被抗体浓度为：用,9,2,、加抗原：,！稀释抗原用加,BSA,的保温液稀释！,如上页图所示，加抗原，空白和荧光阴性对照加含,BSA,的保温液,标准抗原,1-5,的浓度分别为：,50,，,100,，,200,，,300,，,500ng/ml(,都从,500ng/ml,加，分别加,10,，,20,，,40,，,60,，,100ul,至各孔，再分别补加,90,，,80,，,60,，,40,，,0ul,保温液即可,),荧光各孔：阴性对照：,Ab-Ag-FITC-Ab,，阳性对照用,200ng/ml,，,500ng/ml,37,，,1hr,，洗涤液洗涤三次,2、加抗原：,10,3,、加酶标抗体、荧光标记抗体：,所有,ELISA,各孔均加,100ul,（已稀释好,稀释倍数：,2000,各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体,100ul,(,已稀释好，稀释倍数：,50),！注意！荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光,37,，,45min,，,取出后保温平衡,10,分钟,洗涤液洗涤三次，荧光各孔可不洗,3、加酶标抗体、荧光标记抗体：,11,4、观察荧光、ELISA各孔加底物：,一组同学观察荧光、一组同学加酶底物。酶底物溶液要现配，由老师或同学代表配制一份即可。各孔加100ul，37保温15min。,终止酶反应：各孔加4mlol/L硫酸50ul终止。,5、酶标仪上测各孔492nm的光吸收。,打印直线附在实验报告上！,4、观察荧光、ELISA各孔加底物：,12,实验三、纳米金免疫检测技术,一、实验原理：,以双抗体夹心法为例。,在硝酸纤维素膜的膜片上滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。,实验三、纳米金免疫检测技术一、实验原理：,13,一、实验原理,本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。,一、实验原理本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。,14,二、实验操作：,点加抗原：（人,IgG,）：在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移液器取,3ul,抗原溶液点于硝酸纤维素膜上，注意点样时要逐次点于膜上，待前次所点液体渗入后再继续点，不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破，致使斑点太大。烤干或吹干，保证抗原能够吸附到膜上，给蛋白质一定吸附时间，否则下步的洗涤有可能将蛋白洗掉！）。,洗涤、封闭：点加,10ul,含,1%BSA,的,PBS,洗涤（,BSA,作用是封闭），待干（注意别让,BSA,覆盖前一步抗原），另点,1,个点（作为阴性对照）。,二、实验操作：点加抗原：（人IgG）：在硝酸纤维素膜下垫吸,15,点加金标抗体：金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10ul，即可在阳性对照点处观察到红色斑点，而阴性对照则无。,点加金标抗体：金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10,16,三、注意事项：,1斑点大小控制。,2勿用力戳破膜。,3给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。,4把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果，指出阳性点和阴性点。,三、注意事项：1斑点大小控制。,17,实验四、免疫荧光检测技术,一、基本原理：,荧光双抗夹心法定位与定量抗原,二、操作：,1,、抗体包被：（同实验二）,2,、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲线，样品加两个稀释浓度，如,1,：,20,，,1,：,40,，另外加一个阳性对照（用人,IgG,标准），每孔做一个复孔，加空白对照共计,8,孔。,3,、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的荧光标记抗人,IgG,抗体（一般为,1,：,80,倍左右），避光,37,保温箱中保温,30-45,分钟。,实验四、免疫荧光检测技术一、基本原理：,18,三、结果处理：于荧光显微镜下观察荧光，并照相，于实验报告上附上你获得的荧光照片，图片标明照片样本、显微镜放大倍数等。,附一张样板,三、结果处理：于荧光显微镜下观察荧光，并照相，于实验报告上,19,