单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0,CRISPR-CAS,基因,编辑技术原理与应用,CRISPR-CAS基因,1,LOREM IPSUM DOLOR,Lorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipisicing elit.,LOREM IPSUM DOLORLorem ipsum d,2,Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)systems,（,常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）,What,01,02,CRISPR,表示成簇的规律间隔的短回文重复序列，而,Cas,是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、基因家族，其可以以序列依赖性的方式对DNA进行切割和靶向作用。,Clustered regularly interspace,3,What,细菌和古细菌一种不断进化适应的,免疫防御机制,实际上就是一种,基因编辑器,What细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制,4,能,怎,好,CRISPR/Cas基因编辑技术能运用于实际中了吗？,相比其它编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术好用吗？,怎么用CRISPR/Cas基因编辑技术？,能怎好CRISPR/Cas基因编辑技术能运用于实际中了吗？相,5,目录,发现,原理,应用,优点,缺点,发展,前景,CRISPR/Cas基因编辑技术,目录 发现原理应用优点缺点发展前景CRISPR/Cas基因编,6,发现,在,1987,年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是,一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。,他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。,2000,年，相似的重复序列在其它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSR）。,2002,年SRSR被重命名为CRISPR。,发现 在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报,7,2013,年,2,月发表在,Science,杂志上的两篇,文章发现,CRISPR/Cas,9,系统,能在,293T,K562,等多种细胞中进行有效,的靶向,酶切,非,同源,末端,连接同源重组效率,约,在在,3-25,%,之间,与被,Science,杂志评为,2012,年十大科学突破之一的,TALEN,技术,的酶切效果,相当,。,可用于编辑人类基因组。,发现,2013年2月发表在Science杂志上的两篇文章发现C,8,原理,CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。,原理CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DN,9,原理示意图,原理示意图,10,RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统,利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀代表着不同的Cas9酶,RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统利用CRISP,11,用,CRISPR/Cas,技术绕过了胚胎干细胞操作,过程,可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在,胚胎干细胞上,操作,可用于多生物细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠,及少数,大鼠中,任何,可进行胚胎操作,的物种都能成为基因组工程的目标。,应用,用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作,12,应用,Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。,应用Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR,13,应用,。,基因编辑,功能应用,疾病治疗,方向,应用,疾病模式,动物,应用 基因编辑疾病治疗方向应用疾病模式,14,疾病模式动物,科学家们一直改变与特定疾病相关的基因来用小鼠或其他模型动物建立相应的疾病模型。研究者可以应用这些疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病发生过程,;,也可用于筛选有效治疗药物,或通过研究特异的表面分子、信号通路等开发新的靶向治疗药物等。,疾病模式动物,疾病模式动物 科学家们一直改变与特定疾病相关的基,15,传统方式,缺 陷,用特定的手段将目的,DNA,片段插入到小,鼠胚胎干细胞,中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操作技术将其移入到早期胚胎,(,即囊庇,),中,将改造后的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾病模型。,成本,高,应用的物种,有限,操纵,的基因,亦有限,。,传统方式缺 陷用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚,16,基因编辑功能应用,CRISPR-Cas9,系统的基因编辑功能主要,应用于在不同物种的基因组产生,需要,的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模型,。,如果,CRISPR-Cas9,系统的基因编辑功能如果真如研究者报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。,基因编辑功能应用 CRISPR-Cas9系统的基,17,疾病治疗,方向,应用,以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，如,血液病、肿瘤和其他遗传疾病,。CRISPR/Cas9在多种类型的细胞和组织中都具有高效精确的基因编辑能力，在CAR-T、造血干细胞等,体外,治疗手段中是一个非常理想的操作平台，在,体内,也可适用。,疾病治疗方向应用以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术,18,CRISPR/Cas技术灵魂人物Feng Zhang（,张锋,）,MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstitute for Brain Research）助理教授Feng Zhang获得瓦利基金青年研究家奖（Vallee Foundation Young Investigator Award）。Feng Zhang目前的研究方向是设计新的分子工具来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（Broad Institute）的核心成员。,CRISPR/Cas技术灵魂人物Feng Zhang（张,19,“,现在，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因。这个系统可以让科学家们更简便地研究不同基因的功能。,”,改造后的CRISPR技术，可以快速对整个基因组进行功能筛选，帮助人们鉴定涉及特定疾病的基因。张锋等人在这项研究中就鉴定了让黑色素瘤细胞抵抗癌症药物的几个基因。,“现在，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因。这个系,20,基因敲除的四种方法,1,2,3,4,锌指核酸酶(ZFN),ES 细胞打靶,类转录活化因子核酸酶(TALEN),CRISPR/Cas基因编辑技术,基因敲除的四种方法 1234锌指核酸酶(ZFN)ES 细胞打,21,锌指核酸酶(ZFN),01,02,03,构成：锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。,作用：增强线虫的同源重组,前景：ZFN技术亦具有潜在的临床应用前景。,04,缺陷：,1,、不能预期引入的ZFN蛋白是 不是会引起免疫系统的进攻。,2,、直接体内注入基因的效率低。,3,、在细胞内精确度难以预估。,锌指核酸酶(ZFN)010203构成：锌指核糖核酸酶（ZF,22,定义,基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。,ES 细胞打靶,原理,获得ES细胞系，用同源重组技术获得带有预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。ES细胞仍然保持分化的全能性，可发育为嵌合体动物的生殖细胞，使修饰,过,的遗传信息经生殖系遗传。获得,的,突变动物提供,了,一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。,应用,基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物模型、改良动物品系和研制动物反应器等。,定义基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特,23,类转录活化因子核酸酶(TALEN),01,02,03,04,优点：设计更简单，特异性更高。,缺点：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司,应用：基于TALE的基因组编辑技术已经被广泛作用于基因敲除、敲入、转录激活等。,简介,;,TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。,类转录活化因子核酸酶(TALEN)01020304优点：设计,24,利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，单基因敲出的效率只有30%。,传统的基因敲除方法需要通过打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、技术要求很高，而且费用大、耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。,其他技术的不足,利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，可,25,方法,靶标,质粒构建,基因下调,基因敲除,基因定点突变或多点突变,基因组改变,遗传密码子改变,遗传性,RNAi(siRNA,shRNA),mRNA,（转录水平）,简单,yes,NO,NO,NO,siRNA,：瞬转；,shRNA:,可借助慢病毒实现遗传性,CRISPR,DNA,序列（基因组水平）,简单,yes,yes,yes,yes,yes,TALEN,DNA,序列（基因组水平）,复杂,yes,yes,yes,yes,yes,方法靶标质粒构建基因下调基因敲除基因定点突变或多点突变基因组,26,操作简单，靶向精确性更高，成本低,可对靶基因单个位点或多个位点同时敲除,可同时对多个靶基因进行敲除,是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传,可应用于任何物种,拥有CRISPR/Cas9腺病毒/慢病毒系统，对分裂期和非分裂期细胞均有感染作用,。,优点,更容易得到纯合子突变体,操作简单，靶向精确性更高，成本低可对靶基因单个位点或多个位点,27,缺点,传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。,该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究,缺点传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠,28,缺点,CRISPR-Cas技术尤其是CRISPR-Cas9作为基因编辑的核心技术，它仍然是一项非常新颖的技术，除了存在“脱靶”的主要问题外，还有许多的技术难点尚未突破，尤其是,临床应用的有效性和安全性,依然是科学家关注和争论的焦点。,缺点CRISPR-Cas技术尤其是CRISPR-Cas9作为,29,进展,01,02,03,04,05,06,细菌，哺乳动物,干细胞的定点突变,多基因 打靶,斑马鱼,拟南芥,靶序列互补,进展 010203040506细菌，哺乳动物干细胞的定点突变,30,1 随着 CISP/Cas 技术的快速发展,它已经被广泛应用于细菌、人类胚胎干细胞、哺乳动物细胞、酿酒酵母、线虫、果蝇和农作物等的基因研究，并具有操作简单、快速、靶向精确性高、可实现对靶基因多个位点同时敲除等特点。,在细菌研究方面，确定了副溶血性弧菌的 6 个不同的 CISP序列类型，同时 CISP 序列类型被认为与毒力因子测试