单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时定量PCR技术的原理及应用,(Real time Quantitative PCR),讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,医学和科研中的应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,医学和科研中的应用,实时定量PCR定义,在PCR反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时定量PCR 原理,实时原理,常规PCR技术：,对PCR扩增反应的,终点产物,进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,实时定量PCR原理-扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（Cycle）；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,实时定量PCR 原理 -荧光,阈,值,荧光信号,阈,值（threshold）,：,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,），,即,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,真正的信号,:,荧光信号超过域值,阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上,设定的荧光检出界限,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,Ct值的重现性,横轴：PCR反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,定量原理,在扩增产物达到阈值线时:,X,Ct,=X,0,(1+Ex),Ct,=M (1),X,Ct,:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M,方程式(1)两边同时取对数得:,log M=log X,0,(1+Ex),Ct,(2),log,X,0,=-log(1+Ex)*,Ct,+log M,(3),模板,DNA,量越多，荧光达到,阈,值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系,标准曲线,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，,根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,25,非特异性荧光标记：,1、SYBR Green,特异性荧光标记：,2、TaqMan,3、Molecular Beacon,4、Amplisensor,实时荧光定量PCR 原理 -DNA 产物的荧光标记,Q,Q,R,实时荧光定量PCR 方法 1-,SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作机理,SYBR Green,能,结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,荧光染料嵌合法,(SYBR Green I),作用机理示意图,实时荧光定量PCR原理,SYBR Green I 熔解曲线分析,温度,荧光强度,Tm,Tm值：DNA解链一半时的温度,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化:,SYBR Green,使用浓度,:,太高抑制,Taq,酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测,Primer,：,引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准,MgCl,2,的浓度,:,可以降低到,1.5mM,以减少非特异性产物,反应,Buffer,体系的优化,反应温度和时间参数,:,由酶和引物决定,其他与常规,PCR,相同,利用SYBR Green 法定量检测样品DNA,SYBR Green 法优缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性,但可以通过,融解曲线的分析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,与目标序列互补,实时荧光定量PCR 方法2-TaqMan法,TaqMan-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan法优缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,以前对,PCR,引物的选择、,PCR,试剂的优化经验不足，,Probe,法较为广用。但是,Real Time,将进入,SYBR Green I,时代,设计合适的引物，使用SYBR Green I将会更加便宜，,更为方便，并拥有良好的特异性。,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标,内标通常是,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度,根据质粒或,cDNA,分子量换算成拷贝数，做系列稀释,用于生成标准曲线的样品如何设定？,数据分析,分析结果：HBV DNA的精确copy数为,3.7X10,5,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,已肝病人血液中HBV的绝对定量,目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据,方法：从血液中提取病毒,DNA,，,扩增病毒基因，以,TaqMan,探针进行检测,设置对照：浓度为,10,6,、,10,5,、,10,4,10,3,的标准样品各一个，设阴性和空白对照,实验步骤：提取,HBV DNA,设计特异引物,设计,TaqMan,探针并标记探针,扩增程序,结果：获取血液样品中,HBV DNA,的精确,copy,数,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,