单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 离子交换层析及凝胶过滤介质,1,第九章 离子交换层析及凝胶过滤介质1,一、基本原理,离子交换剂是由基质、,电荷基团,(,或功能基团,),和,反离子,构成的，基质与电荷基因以共价键连 接，电荷基因与反离子以离子键结合。,离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以,RA,+,代表阳离子交换剂，其中,A,+,为反离子，,A,+,能够与溶液中的阳离子,B,+,发生可逆的交换反应，反应式为：,RA,+,+B,+,RB,+,+A,+,离子交换层析,离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质,(,例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等,),的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。,2,一、基本原理 离子交换层析2,离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）,3,离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）,离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。,强酸性,(,阳性,),离子交换剂对,H,+,的结合力比对,Na,+,的小；,强碱性,(,阴性,),离子交换剂对,OH,-,的结合力比对,Cl,-,的小得多；,弱酸性,离子交换剂对,H,+,的结合力远比对,Na,+,的大；,弱碱性,离子交换剂对,OH,-,的结合力比对,Cl,-,的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子,(,离子在水溶液中发生水化作用形成的,),的,结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比,。所以，,离子价数越高，结合力越大,。在离子间电荷相同时，则离子的,原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大,。,4,离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合,两性离子,如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定,pH,条件下呈现的离子状态。当,pH,低于等电点,(pI),时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，,pH,高于,pI,时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。,pH,与,pI,的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。,离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。,5,两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换,6,6,氨基酸的离子交换分离原理,7,氨基酸的离子交换分离原理7,What happens in ion exchange?,Equilibration,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,anion exchange bead,8,What happens in ion exchange?E,What happens in ion exchange?,Sample application,and wash,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,9,What happens in ion exchange?S,What happens in ion exchange?,Elution,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,10,What happens in ion exchange?E,What happens in ion exchange?,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,11,What happens in ion exchange?R,What happens in ion exchange?,Sample,application,and wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,12,What happens in ion exchange?S,1,上样阶段,，此时离子交换剂与平衡离子结合,；（平衡,阶段）,2,吸附阶段,，混合样品中的分子与离子交换剂结合；,3,开始解吸阶段,，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱,而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；,4,完全解吸阶段,，目标分子被洗脱；,5,再生阶段,，用起始缓冲液重新平衡层析柱，,以备下次,使用。,离子交换层析一般步骤,13,1上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；（平衡 离子交换,氨基酸的分离过程,14,氨基酸的分离过程14,二、离子交换剂的部分性质,粒度,基质颗粒大小直接关系到分离效果，颗粒越小，层,析柱的理论塔板数就越大，分离效果越好，但同时,交换容量变小，层析时背景压力增大，限制了流速,的提高，因此细颗粒的介质常适用于分析型分离；,相反，基质颗粒越大，柱效率会下降，但离子交换,剂的交换容量提高，背景压力减小，因此大颗粒介,质适合于实验室小规模分离及大规模工业化分离。,15,二、离子交换剂的部分性质15,交联度和网孔结构,交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。,一般交联度越高，网孔的孔径越小；交联度越低，网孔孔径越大。仅琼脂糖交换剂是例外,.,16,交联度和网孔结构16,交联度和网孔结构,分离介质的孔有,3,种结构。第一种通过交联使大分子链间形成孔，这叫凝胶孔。,第二种在有溶剂存在条件下进行聚合，称为大孔树脂。,第三种为琼脂糖介质的孔，孔径大小仅与琼脂糖浓度有关，交联对孔结构影响不大。,17,交联度和网孔结构17,电荷密度,电荷密度是指基质颗粒上单位表面积的取代基（功能集团）的数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分子进行离子交换时，交换剂上功能基团密度越大，工作能力越强，高电荷密度的离子交换剂具有优势。,18,电荷密度18,膨胀度,又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在,水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通,常用每克干胶吸水膨胀后的体积（毫升）,来表示。,19,膨胀度19,交换容量,交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。,总交换容量,用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示,.,可以通过酸碱滴定的方法来测定，也可使得离子交换剂和某种小的离子之间发生完全交换，然后通过测定该离子的含量算出总交换容量，总交换容量并不反映交换剂对可交换分子的结合情况,.,20,交换容量20,有效交换容量,指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同时指出实验条件,.,一般情况下，同一种交换剂对于分子量小的蛋白质有效交换容量较大，而对于分子量大的蛋白质有效容量较小；对于同一种蛋白质，离子交换剂的交联度越小有效容量越大，而交联度越大有效容量越小。,21,有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某,二、离子交换剂,离子交换剂应满足的基本条件有：,有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解；,有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；,有较多的交换基团；,有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。,22,二、离子交换剂 22,(,一,),离子交换剂的种类,根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：,1.,疏水性离子交换剂,疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂。常用的,树脂,是由,苯乙烯和二乙烯苯,合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂,(,分别包括强、中、弱三种电荷基团,),和螯合离子交换树脂,(,对金属离子有较强的选择性,),。,23,(一)离子交换剂的种类 23,(1),阳离子交换剂,阳离子交换剂,的电荷基团带负电，,反离子带正电,。因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型,(,带磺酸基团,),、中强酸型,(,带磷酸基团或亚磷酸基团,),和弱酸型,(,带羧基的或酚基,),三种。,(2),阴离子交换剂,阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺,-N(CH,3,),3,、叔胺,-N(CH,3,),2,、仲胺,-NHCH,3,和伯胺,-NH,2,基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。,24,(1)阳离子交换剂 24,树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小在,20-50,目之间。近年,Bio-Rad,公司还制造了,50-100,目、,100-200,目以及,200-400,目的产品，目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的。,疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量高、机械强度大、流动速度快。因此，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂,(,如十二烷基硫酸钠,),、清洁剂,(,如,tritonX-100),、尿素、两性电解质,(Ampholyte),。此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。,25,树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小在2,疏水性的离子交换剂对带,电荷多和疏水性强,的被分离物,有较强的截留能力,。,阳离子交换树脂对氨基酸的分离,26,疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留,2.,亲水性离子交换剂,这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有多种类型：,(1),纤维素离子交换型,以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基,(P.,中强酸型,),、磺酸乙基,(SE,，强酸型,),、羧甲基,(CM,、弱酸型,),、三乙基氨基乙基,(TEAE,，强碱型,),、二乙氨基乙基,(DEAE,，弱碱型,),、氨基乙基,(AE,，中等碱型,),、三乙醇基氨基,(ECTE,，中等碱型,),等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，,Pharmacia,(GE),公司生产的,DEAE-Sephacel,为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好，对蛋白质、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交换容量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。此外，,Watman,公司的,DE-,、,CM-,、,P-,、,AE-,、,SE-,及,QA-,纤维素，,Bio-Rad,公司的,CellexD,、,CellexE,、,CellexP,和,CellexCM,，及一些国产的,DEAE-,纤维素和,CM-,纤维素也可选择使用。,27,2.亲水性离子交换剂 27,(2),葡聚糖系离子交换剂,以,SephadexG25,和,G50,为基质，分别引入,DEAE,、,QAE(,二乙基,(,二羧 丙基,),氨基乙基，弱碱型,),、,CM,、,SP(,磺丙基、强酸型,),等功能基因，构成,8,种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离