单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/12/9,精选ppt,#,酵母细胞表面展示技术及其在高通量筛选中的应用,1,精选ppt,酵母细胞表面展示技术及其在高通量筛选中的应用 1精选ppt,目录,酵母细胞表面展示,技术,的概述,酵母细胞表面展示,技术在,高通量筛选中的应用,2,精选ppt,目录酵母细胞表面展示技术的概述2精选ppt,酵母细胞表面展示技术概念,酵母细胞表面展示技术基本原理,酵母细胞表面展示技术常见系统,酵母细胞表面展示技术,的概述,酵母细胞表面展示技术的特点,3,精选ppt,酵母细胞表面展示技术概念酵母细胞表面展示技术基本原理酵母细胞,酵母细胞表面展示技术,的,概述,酵母细胞表面展示,技术,(,Surface Display,),是,一种真核蛋白,表达系统。它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点,，,在医 药、食品,、生物燃料等多,个工业领域都 有,广泛的应用,前景。,4,精选ppt,酵母细胞表面展示技术的概述 酵母细胞表面展示技术(Surfa,基本原理：是将外源靶蛋白基因与,特定的,载体基因序列融合后导入酵母细胞,，用,酵母细胞内蛋白转运机制将目的,蛋白转移,至细胞表面并且固定在细胞膜上。与其它表面,展示,系统相比,酵母表面展示系统可克服真核蛋白在原核细胞表达时活性降低或失活的,缺点。,5,精选ppt,基本原理：是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵,最,常见的酵母表面展示表达系统,包括,:,凝集素,展示表达,和,絮凝素展示,表达,是,将外源基因与酵母,编码,-,凝集素,C,端,编码,序列,(,含,GPI,锚,定,信号序列,),连接,后插入,质粒,载体的信号肽下游,融合蛋白诱导表达,后,信号肽引导,嵌合蛋白向细胞外分泌,由于融合,蛋白,C-,末端存在含,GPI,锚,定信号的凝集素多肽序列,可将,蛋白锚,定在酵母细胞壁,中,从而将蛋白分子展示表达,在酵母,细胞,表面。,凝集素展示表达,6,精选ppt,最常见的酵母表面展示表达系统包括:凝集素展示表达和絮凝,凝集素,系统又,分为,-,凝集素,(,Ag,),系统,和,a,-,凝集素,(Aga),系统,在,-,凝集素系统中,，,凝集素,的,C,端可,锚定在酵母,细胞,壁的葡聚糖,上,，,外源,蛋白,作为,N,端与,凝集素,C,端融合,，,在信号肽,引导下分泌,表达,，,从而,实现了外源蛋白的展示,表达。,a,-,凝集素,是,Agalp,和,Aga2p,亚,单位通过二硫桥,相连,，,其中,Agalp,通过,-,葡聚糖,共价连接在细胞壁,上，目的蛋白与,Aga2p,的,N,端,融合表达后,，再通过,Agalp,与,酵母细胞壁,的共,价连接而展示在细胞,表面。,7,精选ppt,凝集素系统又分为-凝集素(Ag)系统和a-凝集素(Aga,絮凝,素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白,融合,并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两,个子统,:,GPI,锚定系统,和,絮凝结构域锚定,系统,。,GPI,锚定系统,是利用絮凝,素,FLo1p,的,C-,末端含有,的,GPI,信号,锚定外源,蛋白,此,系统与凝集素展示相似,。,絮凝结构域锚定系统,是利用,FLo1p,的,中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物,。,絮凝素展示表达,8,精选ppt,絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将融合,9,精选ppt,9精选ppt,酵母表面展示技术的特点,表达偏差小,融合蛋白相对分子质量范围大,筛选、纯化、活性测定方便,融合蛋白分子数量多,特点,10,精选ppt,酵母表面展示技术的特点表达偏差小融合蛋白相对分子质量范围大筛,酵母表面,展示,酵母表面展示系统的应用,酒精发酵,生物吸附,高通量筛选,11,精选ppt,酵母表面展示酵母表面展示系统的应用酒精发酵生物吸附高通量筛选,为了,简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行，莫春,玲等通过,酵母细胞表面展示,技术,，以酿酒酵母菌株,Saccharomyces cerevisiae Y5,为受体，通过絮凝素,(,Flo1p,),锚定方式，将来自丝状真菌,里氏,木霉,Trichoderma reesei,的内切葡聚糖酶,(,EGII,),、纤维二糖水解酶,(CBHII),以及来自棘孢曲霉,Aspergillusaculeatus,的,-,葡糖苷酶,(BGLI),展示在细胞表面，构建同时表达,3,种纤维素酶的酵母菌群系统,。,经过免疫荧光验证,展示酶的细胞蛋白定位，酶活测定，乙醇发酵性能验证，结果表明：展示表达,的,3,种,纤维素酶具有,良好的,稳定性和功能活性,；,乙醇,发酵,12,精选ppt,为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙,该,系统,已经,得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多,亟待,解决的问题，例如：展示在细胞表面的,纤维素酶,的活性与游离酶相比有所下降；成功展示的,纤维素酶,稳定性有待,提高。,即使如此,，利用酵母表面展示技术表达,纤维素酶,的新型酵母菌群进行纤维素乙醇发酵,效果,还不是很理想，乙醇产率较低，难以满足,实际,生产,需求。,在,EGII,、,CBHII,和,BGLI,协同作用,下重组酵母菌株能够水解溶胀磷酸纤维素,(,Phosphoric acid swollen cellulose,，简称,PASC,),并,产生乙醇，乙醇浓度达到最大,值,0.77 g/L,，乙醇产量,为,0.35,g/L,，,相当于理论值,的,68.6%,。,13,精选ppt,该系统已经得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多亟待解,酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的,应用,高通量筛选,高通量筛选的概念,1,酵母细胞展示在,HTS,中的主要应用,3,高通量筛选的技术过程,2,14,精选ppt,酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用高通量筛选高通量筛选,什么是,high-throughput,screening,高通量筛选（,HTS,）,又称大规模集群式筛选，是由高容量化合物库、自动化操作、高灵敏度检测、高特异筛选模型、高效率数据处理,5,个子系统有机组合而成，是一种新型的筛选技术。,15,精选ppt,什么是high-throughput screening15,高通量筛选的技术,过程,1,、样品库,2,、初筛和复筛,3,、活性化合物,4,、深入筛选,5,、获得少量先导化合物,6,、确证筛选药物药理学研究,7,、侯选药物,8,、临床前研究,16,精选ppt,高通量筛选的技术过程1、样品库16精选ppt,药物筛选,定向进化,酵母展示在高通量筛选中的应用,17,精选ppt,药物筛选定向进化酵母展示在高通量筛选中的应用17精选ppt,药物筛选,把,酵母应用于药物筛选，最早始于利用酵母,双杂交,技术来确定药物靶点,。,随,之发展起来的基于,靶点,的药物筛选至今已有大量成功,先例。,选择的,靶点基本上可分为四种类型,：,离子通道,、,核,受体,、,G,蛋白偶联受体,(GPCRs),和,酶,。,18,精选ppt,药物筛选 把酵母应用于药物筛选，最早始于利用酵,直接活性,筛选,可通过酵母系统直接进行,化合物,活性,筛选,，,这,主要源于两种情况,:,(,1),在离子,转运,缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生,补充,生长的表型,；,(,2),在酵母中表达离子通道蛋白可,导致,酵母生长缺陷,。,在,筛选离子通道抑制剂时，前,种情况,可筛选那些导致酵母生长受抑的化合物，,而后种,情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长的,化合物,。,离子通道,19,精选ppt,直接活性筛选离子通道19精选ppt,Hahnenberger,和,Kurtz,建立了酵母展示的,系统来筛选钾离子通道、质子通道和钠,/,氢离子通道,的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道,蛋白,M2,的,表达能导致酵母生长缺陷，因此，,理论上那些,能使酵母恢复生长的化合物就是,M2,的,抑制剂,。据此，他们,筛选得到了一个流行性感冒质子通道,蛋白,的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法进行,抑制剂,筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物,虽然,不是离子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。,为此,，,Hahnenberger,和,Kurtz,设计,了微生理,测量计,，能检测出反映离子通道功能的,pH,变化,，为,假阳性,的剔除提供了一个快速的二次检验方法,。,20,精选ppt,Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展,酵母双杂交筛选,由于离子通道蛋白是多亚基结构，亚基间的作用一旦被破坏，离子通道的功能就会受到影响，因此，利用酵母双杂交可筛选那些破坏亚基间相互作用的化合物，即该离子通道的抑制剂。,Young,等成功,筛选得到了能抑制,N,-,型,钙离子通道,3,亚基,和,1B,亚基间相互作用的化合物,，且,这些化合物在随后的功能性实验中的确表现出了,钙离子通道,抑制剂的活性。这些工作,不仅成功,地将酵母双杂交应用于药物筛选,，而且,还把,酵母双,杂交成功地引入到膜蛋白相互作用的研究中。,21,精选ppt,酵母双杂交筛选 21精选ppt,核受体,Taniguchi,等建立,了一个,酵母,双杂交系统来筛选人过氧化物酶体增殖剂激活,受体,(PPAR),的激动剂与半激动剂,。,G,蛋白偶联受体,在此类筛选中，工程酵母中的酵母接合,信息素受体,Ste2p,为人的,G,蛋白偶联受体,(GPCRs),所取代,，同时,在可筛选的报告基因上游引入接合特有的启动元件。这种工程酵母可用于高通量筛选人,G,蛋白偶,联受体,(GPCRs),的半激动剂和激动,剂。,一般来说，酶通常不需要几个蛋白共同作用,来发挥,其功能，且酶的结构各异，因此，酶抑制剂的筛选比以上几种蛋白要困难得多,。,酶,22,精选ppt,核受体Taniguchi等建立了一个酵母双杂交系统来筛选人过,通常被选的展示系统应该满足以下几个条件,：,1.,表达偏差,应该是最小的，以便,DNA,库的多样性可代表正确折叠蛋白质的,多样性,。,2.,要,有定量筛选的,标准,。,3.,被,选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体,。,定向进化,23,精选ppt,通常被选的展示系统应该满足以下几个条件：定向进化23精选pp,为什么,要通过酵母细胞展示进行高通量筛选,1.,虽然噬菌体,表面展示在抗原表位分析、抗体筛选、,抗体,酶和蛋白酶抑制剂研究,等,方面得到,广泛、成功,的,应用，但是,噬菌体表面展示利用原核表达,系统，不能,展示需糖基,化、二硫键,异构化等翻译后修饰,才表现,功能活性的复杂真核蛋白。,2.,酵母,表面展示,系统弥补,了噬菌体展示技术的此项不足,能使复杂,真核蛋白,得到展示,同时又保留了噬菌体表面展示,技术的,便于筛选、扩增等优点。,24,精选ppt,为什么要通过酵母细胞展示进行高通量筛选1.虽然噬菌体表面展,1.,酿酒酵母,的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质,。,2.,与,噬菌体不同，酵母是个足够大的,颗粒,，,可用,流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能,。,3.,由于,酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受,SDS,等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景,。,4,.,在应用过程中，细胞表面展示技术结合流式细胞仪在筛选的高通量和测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好平衡。甚至在高密度的固体形态或微量滴定量,L,板测活，也能准确定量酶的活力,。,酵母细胞展示系统在高通量筛选应用中的优点,25,精选ppt,1.酿酒酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，,综上所述，基于酵母展示系统的高通量筛选技术在工业应用上的前景将非常广阔。,26,精选ppt,综上所述，基于酵母展示系统的高通