,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,荧光免疫标记技术,荧光免疫标记技术,第1页,知识目标,技能目标,素质目标,1.,重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在医学检验中应用,2.,熟悉荧光基础知识、荧光免疫分析常见仪器和设备,3.,了解荧光抗体制备,1.,会使用荧光显微镜等常见仪器和设备,2.,会用荧光免疫技术检测抗原抗体,3.,能将荧光免疫测定与临床应用相联络,经过学生相互勉励、严谨、认真操作，各小组共同协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通能力,任务目标,荧光免疫标记技术,第2页,1,荧光标识物制备,2,荧光免疫组织化学技术,3,其它荧光免疫技术,任务对象,荧光免疫标记技术,第3页,任务过程,复习提问,案例导入,讲解与示教,学生操作,讨论分析,评价、考评,课后思索题,教,学,环,节,2,30,2,10,40,5,1,荧光免疫标记技术,第4页,患儿，男，间断发烧五天，伴咳嗽3天。体温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊疗,“,呼吸道感染,”,并静滴,“,阿奇霉素,”,3天，无显著改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提醒：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？怎样快速诊疗？,案例导入,荧光免疫标记技术,第5页,老师纠正,点评,学生操作,一位学生,操作演示,学生分组,再操作,荧光免疫标记技术,第6页,【,主要试剂与器材,】,1.,抗原基质片 固定有核抗原，可采取小鼠肝组织切,片或印片经丙酮固定即可。当前有商品化试剂供给。,2.,标识抗体,FITC,标识羊抗人,IgG,，有商品化试剂供,应。临用时稀释至工作浓度。,3.0.01mol/L pH7.2PBS,。,4.,缓冲甘油,9,份甘油和,1,份,PBS,混匀。,5.,待检血清，阴性、阳性对照血清。,6.,其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。,试验操作,荧光免疫标记技术,第7页,【,操作方法,】,1.,自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈标识。,2.,将待检血清和对照血清用,PBS,作,110,稀释，用微量加样器加,50l,待检血清或对照血清于基质片上，水平置于湿盒中,37oC,温箱反应,30min,。,3.,以,PBS,冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有,PBS,染色缸中，重复漂洗,3,次，每次,5min,。,4.,取出玻片，吹干，加,50l,最适工作浓度标识抗体，平置于湿盒内，,37oC,温箱反应,30min,。,5.,重复步骤,3,，洗去未结合荧光抗体。,6.,滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。,试验操作,荧光免疫标记技术,第8页,【,结果判断,】,1.,荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；反之为阴性。,2.,依据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：,均质型,:,细胞核呈均匀一致荧光。,周围型,:,细胞核周围展现荧光，核中央染色弱或无荧光。,斑点型：细胞核展现斑点状荧光。,核仁型：核仁个别展现荧光。,试验操作,试验操作,荧光免疫标记技术,第9页,【,注意事项,】,1.,滴加血清或标识抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间预防交叉污染。反应时应置于湿盒内，预防干燥。,2.,每次冲片应彻底，预防非特异荧光干扰。,3.,荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注意低温避光保留。,试验操作,荧光免疫标记技术,第10页,【,应用与评价,】,荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物判定及其抗体检测；本身免疫病本身抗体检测，免疫细胞表面抗原检测等。,此方法检测,ANA,，主要用于初步筛查，含有简便、快速、敏感等特点。,试验操作,荧光免疫标记技术,第11页,讨论分析,提 出 问 题,展 开 讨 论,用什么能够,观察到荧光？,为何有荧,光就能做出,诊疗？,荧光免疫标记技术,第12页,免疫荧光技术（,Immunofluorescence technique,）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上建立起来一项技术。,该技术主要优缺点,主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。,主要缺点：非特异性染色问题还未完全解 决，结果判定客观性不足，技术程序也还比较复杂。,免疫荧光技术,讨论分析,荧光免疫标记技术,第13页,免疫荧光技术是将抗原抗体反应特异性和敏感性与显微示踪准确性相结合。,以荧光素作为标识物，与已知抗体,(,或抗原,),结合、但不影响其免疫学特征。然后将荧光素标识抗体作为标准试剂，用于检测和判定未知抗原。,在荧光显微镜下，能够直接观察展现特异荧光抗原抗体复合物及其存在部位。,免疫荧光技术,-,基础原理,讨论分析,荧光免疫标记技术,第14页,荧光是指一个分子或原子吸收了给予能量后，即刻引发发光；停顿能量供给，发光亦瞬即停顿。荧光素是一个可吸收激发光光便能产生荧光，并能作为染料使用有机化合物，亦称荧光色素。,发生原理,-,基态激发态,产生特点：激发,-,即刻产生,停顿激发,-,瞬间消失,种类,-,光致荧光，化学荧光，,X,线荧光，阴极射线荧光,讨论分析,荧光,荧光免疫标记技术,第15页,荧光寿命,-,荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生荧光衰减到一定程度所用时间。,荧光淬灭,-,荧光物质荧光辐射能力在受到激发光较长时间照射后发生减弱现象。,淬灭剂,-,苯胺、硝基苯、酚等,荧光（标识）物质保留,荧光,讨论分析,荧光免疫标记技术,第16页,荧光色素,:,能够产生显著荧光并能作为染料使用有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标识抗体荧光色素，必须含有化学上活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标识抗体生物活性及抗原抗体特异性结合。,讨论分析,异硫氰酸荧光素,(FITC),荧光免疫标记技术,第17页,荧光,FITC+RB200,标识,讨论分析,荧光免疫标记技术,第18页,光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯,滤板：隔热滤板、激光滤板（,UG,、,BG,）、吸收滤板（,OG,、,GG,）,光路：透射光、落射光,荧光显微镜,讨论分析,荧光免疫标记技术,第19页,a,透射光,b,落射光,讨论分析,荧光免疫标记技术,第20页,荧光显微镜,台式机,-FACSCalibur,双激光,-488nm,635nm,四荧光参数,分选、浓缩系统,讨论分析,荧光免疫标记技术,第21页,大型机,-FACSVantage SE,多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选,讨论分析,荧光免疫标记技术,第22页,基础原理,-,荧光显微镜；荧光,Ab,；标本（组织或细胞中,Ag),技术类型：,直接法,-,荧光素标识,Ab,直接检测,间接法,-,荧光素标识二抗,补体结正当,-,荧光素标识抗补体,Ab,双结正当,-,两种荧光素标识,Ab,重点,荧光免疫显微技术,讨论分析,荧光免疫标记技术,第23页,讨论分析,荧光免疫标记技术,第24页,间接免疫荧光检测本身抗核抗体,讨论分析,荧光免疫标记技术,第25页,FALS Sensor,Laser,前向角散射光（,FSC,）：反应细胞大小,荧光免疫显微技术,讨论分析,荧光免疫标记技术,第26页,FALS Sensor,90LS Sensor,Laser,侧向角散射光（,SSC,）：反应细胞内颗粒多少,荧光免疫显微技术,讨论分析,荧光免疫标记技术,第27页,双色直接染色细胞,T,细胞,B,细胞,荧光免疫显微技术,讨论分析,荧光免疫标记技术,第28页,直方图分析：对细胞某一个单参数进行统计分析,横坐标为荧光或散射光强度,纵坐标为细胞数,荧光免疫显微技术,荧光免疫标记技术,第29页,讨论分析,荧光免疫标记技术,第30页,间接免疫荧光法示意图,讨论分析,荧光免疫标记技术,第31页,荧光免疫显微技术在医学检验中应用：,细菌检验,-,细菌培养物、感染组织、病人分泌排泄物等（菌种判定）,病毒检验,-,特殊意义,亦可检测血清中,Ab(,间接法,)-,流行病学调查和临床回顾性诊疗,寄生虫检验,-,间接法测,Ab,如抗疟,Ab,、阿米巴,Ab,等,本身,Ab,检测,讨论分析,荧光免疫标记技术,第32页,配分与评分标准,序号,考评关键点,分值,评分标准,得分,1,2,抗原基质片，平衡至室温,(2)记号笔画圈标识,待检血清和对照血清用PBS作110稀释,(2)微量加样器50l待检血清或对照血清于基质片上,水平置于湿盒中37oC温箱反应30min,1,1,1,1,1,不符合要求将此分扣除,不符合要求将此分扣除,考评,荧光免疫标记技术,第33页,配分与评分标准,序号,考评关键点,分值,评分标准,得分,3,以PBS冲洗抗原基质片,(2)浸于盛有PBS染,色缸中,重复漂洗3次,每次5min,1,1,1,不符合要求将此分扣除,考评,荧光免疫标记技术,第34页,配分与评分标准,序号,考评关键点,分值,评分标准,得分,4,取出玻片，吹干,(2)加50l最适工作浓度标识抗体,平置于湿盒内，37oC温箱反应30min,1,1,1,不符合要求将此分扣除,考评,荧光免疫标记技术,第35页,序号,考评关键点,分值,评分标准,得分,5,6,重复步骤3，洗去未结合荧光抗体,(1)滴加缓冲甘油封片,用荧光显微镜观察,1,1,1,1,不符合要求将此分扣除,不符合要求将此分扣除,考评,配分与评分标准,荧光免疫标记技术,第36页,