,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Western Blotting,的原理 方法及常见问题分析,Western Blotting的原理,试验前应预备的试剂及材料,Western Blotting试验步骤,影响Western blotting成功的要素,常见问题分析与对策,南方医科大学中医药学院分子生物学试验室,一、概述,通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进展着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达状况的信息。,Western Blotting,的原理,组织或细胞样品蛋白的提取试剂,蛋白定量试剂,丙烯酰胺凝胶配置试剂,转膜缓冲液试剂,固相载体PVDFNC尼龙膜,封闭液、洗脱液、抗体稀释液,一抗、二抗,化学显影液,二、试验前预备的试剂及材料,2.,7,一抗二抗的选择,2.,7,.1,一抗的选择,2.,7,.2,二抗的选择,二、试验前预备的试剂及材料,3.1组织或细胞样品蛋白的提取,a 蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、,核蛋白、磷酸化蛋白 线粒体蛋白等。,b 样品来源分类：单层贴壁细胞、悬浮细胞,少量或微量组织样品,大量组织样品,难裂解组织样品,一般组织样品,三、Western Blotting试验步骤,3.2蛋白定量,考马斯亮兰法 BCA法 Lowry法,BCA蛋白定量法操作：,三、Western Blotting试验步骤,孔号,0,1,2,3,4,5,6,7,8,蛋白标准溶液（,L,）,0,1,2,4,8,12,16,20,20,去离子水（,L,）,20,19,18,16,12,8,4,0,0,对应蛋白含量（,g,）,0,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.,？,A+B,（,50,：,1,）,200,200,200,200,200,200,200,200,200,振荡30s，37 30分钟，A562nm测定。以蛋白含量g为横坐标，,吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；计算出蛋白含量。,3.3,凝胶浓度的选择及配置,蛋白分子量,(kDa),凝胶浓度,(%),4-40,20,12-45,15,10-70,12.5,15-100,10,25-200,8,三、Western Blotting试验步骤,3.4,蛋白Marker 的作用,预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪,，有利找准自己的目的蛋白。,12%,10%,8%,5%,总体积,10ml,10ml,10ml,2ml,超纯水,3.3,4,4.6,1.4,30%,丙烯酰胺,4,3.3,2.7,0.33,1.5M Tirs,2.5,2.5,2.5,0.25,10%APS,0.1,0.1,0.1,0.02,10%SDS,0.1,0.1,0.1,0.02,TEMED,0.004,0.004,0.006,0.0036,3.6蛋白样品变性时间、温度,3.6蛋白样品上样挨次、体积,3.7电泳,三、Western Blotting试验步骤,？,三、Western Blotting试验步骤,3.8 切胶、泡胶、叠胶,滤纸2张,滤纸1张,PVDF膜1张,滤纸3张,凝胶1块,阳极,阳极,阴极,胶、滤纸、膜浸泡位置,3.9 转膜 时滤纸、胶、膜的叠加挨次,三、Western Blotting试验步骤,半干转膜的条件：,分子量大小,电流=,Sx3,叠加示意图,正极,负极,3.10封闭,3.11洗脱,3.12加一抗 抗体名称、来源、浓度、时间孵育,三、Western Blotting试验步骤,3.13 洗脱,3.14 加二抗抗体名称、来源、浓度、时间,3.15 孵育、洗脱,3.16 加ECL发光液,三、Western Blotting试验步骤,3.17 结果的检测及分析,三、Western Blotting试验步骤,结果分析 例图1,比较均一的高背景,斑点、发泡式或闪烁式的高背景,信号弱或者无信号,非特异性条带,弥散型条带,白色条带、黑点或信号下降太快,常见问题分析,三、,常见问题分析,高背景,原因：,解决办法,抗体浓度太高,优化,/,降低一抗和二抗浓度,抗体孵育温度过高,4孵育,封闭液不适合,比较尝试不同的封闭液,封闭不完全,封闭液的选择与优化,增加封闭液中蛋白质浓度,优化封闭时间和温度（,RT,至少,1,小时；,4,过夜）,抗体与其它蛋白质交叉反应,更换不同的封闭液；,降低二抗浓度,检测二抗与膜的交叉反应性,高背景,原因：,解决办法,漂洗不完全,增加漂洗时间和缓冲液体积,漂洗液中加入,Tween-20,；浓度,0.05,曝光时间太长,缩短曝光时间,膜的问题,使用干净镊子；戴手套操作,换一张新膜,用足够的液体，膜始终保持湿润,孵育时使用脱色摇床,避免膜重叠，互相覆盖,小心操作，勿毁损膜,膜干燥,保证充分的反应液，避免出现干膜现象,缓冲液污染,使用新缓冲液,过滤缓冲液,高背景,如下图:,信号弱或者无信号,原因：,解决办法,转膜不完全,1.,转膜后，染胶以决定转膜效率,2,.,保证转膜时胶与膜充分结合(赶气泡）,3,.,滤纸膜胶，电极方向正确装配,4,.,电转时防止过热（加冰）,5,.,使用阳性对照或预染,Marker,6,.,优化转移时间和电流,7,.,保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇）,蛋白质与膜结合不充分,1.小蛋白转印增加电转移缓冲液中甲醇的浓度至20%；,2.大蛋白转印降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%,3.低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜（0.22u）,一抗、二抗等不匹配,一抗与组织种属相匹配，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配。,抗体,增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性,抗原不足,增加上样量,信号弱或者无信号,抗原被封闭液遮蔽,试用不同的封闭液,优化封闭液中蛋白质浓度,缩短封闭时间,缓冲液里有叠氮钠,去掉叠氮钠,底物孵育时间太短,不少于2分钟,底物丧失活性,ECL发光液的选择及发光也的有效期,底物与二抗孵育发光检测,保证两种底物成分没有交叉污染,膜被剥离过,剥离会导致抗原丢失或变性,避免重复检测,膜上蛋白质被消化（,gelatin),封闭物质可能有蛋白质降解活性,蛋白质在储存过程中降解,重新制备样品,信号弱或者无信号,如下图：,多非特异性条带或条带位置不对,蛋白表达模式的分化,使用原始或传代少的细胞株，或平行实验,体内表达的蛋白具有多种修饰形式,查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小,蛋白样本降解,新鲜制备，并使用蛋白酶抑制剂,一抗浓度过高,降低抗体浓度，可以减少非特异性条带,二抗浓度过高产生非特异性结合,降低抗体浓度，选择特异性更强二抗,抗体未纯化,单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带,蛋白存在二聚体或多聚体,电泳上样前，煮沸,10 min,，增强蛋白质解聚变性,？,多非特异性条带或条带位置不对,如下图:,弥散型条带,原因：,解决办法：,抗体浓度太高,降低抗体浓度,电泳时电压过大,降低电泳时电压（100v）,蛋白质上样量太多,降低蛋白质上样量,其他常见问题,背景有白色/黑色斑点,转膜时有气泡或抗体分布不均,尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动,抗体与封闭剂结合,过滤封闭剂（或更换）,暗片背景白条带,一抗或二抗加入过多,稀释抗体的浓度,目的条带位置过低/过高,SDS-PAGE胶浓度选择不合适,调整胶浓度,“微笑”条带,迁移过快电泳温度过高,降低电泳速度，低温电泳（冷室）,其他常见问题,如下图：,