,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017/12/15,#,western blot,与蛋白质双向电泳的原理，方法及应用,western blot原理及方法,1,蛋白质双向电泳原理及方法,2,医学应用,3,Contents,目,录,第,1,章,western blot原理及方法,一,.,基本原理,PAGE,分离蛋白质,印迹转移,底物显色或者放射自显影,一抗，二抗杂交,二,.,具体的方法和步骤,样品制备与凝胶电泳,转膜与封闭,杂交与显色,I,.,蛋白质样品制备,1.,向细胞悬液中加入蛋白酶抑制剂,2.,细胞裂解液破碎细胞（原理是表面活性剂的两亲性）,3.,水溶液或者有机溶剂提取（后者适用于非极性侧链多的蛋白）,4.,层析或者电洗脱制备目的蛋白,II.SDSPAGE,电泳,问：什么决定了蛋白质能走多远？,首先明白：决定蛋白质运动快慢的是蛋白质带电量和蛋白质的质量,那么：此处是什么起决定作用,?,SDS,所带电荷极多,蛋白质电荷相比之下可以忽略,按体重分电荷,III,.,转膜,转膜两种方法,1.,半干法：,2.,湿法,注意事项：,IV,.,封闭,封闭是什么,?,为什要要进行封闭？,V,.,杂交,问：,什么是一抗，二抗？,一,抗是指对待测蛋白有免疫反应的抗体,二抗是指对一抗有免疫反应的抗体（把一抗当做抗原）,问：,为什么要进行两次免疫反应,?,1.,信号放大，因为一抗可以结合多个二抗,2.,价格便宜，一种二抗可以对多种一抗起作用，只需要找到可以使用的二抗即可,3.,可以,有较多的选择，而且，带标记的二抗可以直接购买,缺点：二次免疫导致的非特异性条带可能影响结果,VI.,显色,第,2,章,蛋白质双向电泳,实验原,理,第一向：等点聚焦电泳（,IEF,，,isoelectric focusing,）,等电聚焦电泳,在聚丙烯凝胶中加入阴离子去污剂,SDS,，,SDS,将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开使蛋白质变性，且包裹在变性蛋白表面。,SDS,带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。不同蛋白质分子的迁移率主要决定于其带有的,SDS,量，即蛋白质分子的大小。电泳中，不同的蛋白质根据其分子大小移动到不同位置，小分子较大分子移动快。,实验方法与步骤,样,品制备,IPG,胶条上样,第,一,向等电聚焦,IPG,胶条平衡,第二向,SDS-PAGE,凝胶的染色,图,像处理分析,样品制备,双,向电泳的最关键步骤之一,原,则：尽可能多地提取总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，防止样品提取过程中的化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质,增,加样品溶解性的方法,：,变性剂，使蛋白质的疏水基团暴露，降低接近疏水残 基的能量域。如尿素、硫脲等,表面活性剂，可溶解疏水基团，如离子去污剂,SDS,，非离子去污剂,NP-40,及两性离子去污剂,CHAPS,，其中,CHAPS,最好,还原剂，可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底,预处理细胞,（清洗等）,除杂质,溶解,破碎细胞,沉淀蛋白质,IPG,胶条上样与第一向等点聚焦,将样品与水化上样缓冲液混合，体积比约为,1:4,混合物加入胶条槽,除去保护膜，将胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极方向放入，慢慢下压，最后放入碱性端（平端），使溶液浸湿胶条，避免生成气泡,在胶条上覆盖适量矿物油，盖上盖,将胶条槽平放在电泳仪上，对好正负极，设定等电聚焦程序,IPG,胶条平衡,聚焦结束的胶,条应立,即进行平衡,将胶条放入平衡缓冲液,中，振荡,15,分钟,将胶条放入平衡缓冲液,中，振荡,15,分,钟,用去离子水润洗胶条,1,秒，用滤纸在胶条边缘吸去多余水分,第二向,SDS-PAGE,胶条染色,硝酸银染色,优,点：灵敏度高,缺,点：重复性低，质谱兼容性低,考马斯亮兰染色,优,点：重复性高，质谱兼容性高,缺,点：灵敏度低,荧光染色,优,点：重复性高，质谱兼容性高，灵敏度高,缺,点：价格贵,硝酸银染色,考马斯亮兰染色,荧光染色,图,像处理分析流程,凝胶图像扫描,图,像加工,斑,点检查与定量,凝,胶配比,数,据分析,数,据呈递和解释,2-DE,数据库的建立,第,3,章,医学应用,01,过敏原检测及方法建立,02,诊断寄生虫病,03,检测基因产物表达及水平,04,检测病毒感染,western blot,的临床应用,由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。,例如鱼类。鱼类是最常见的易引起过敏反应的食物，而小清蛋白是最常见的过敏原。在建立鱼小清蛋白检测及方法建立过程中利用,western blot,法完成免疫鉴定，为低免疫产品研制生产提供理论依据。,过敏原检测及方法建立,诊断寄生虫病,利用,western blot,检测基因产物的表达水平一般应用于肿瘤，糖尿病的由于机体自身病变的疾病诊断中。,应用病例：,成人隐匿型糖尿病：通过免疫印迹四联检测试剂条对319例2型糖尿病患者进行糖尿病自身抗体谷氨酸脱羧酶抗体（GAD）、胰岛细胞抗体（ICA）、胰岛素抗体（IAA）、酪氨酸磷酸化酶自身抗体（IA2）检测，显著高于单一抗体检测。结论检测血清GAD、IA2、IAA、ICA能够为LADA的早期诊断提供依据，同时更好地进行病情评估和治疗方案的调整。,胃癌诊断：采用免疫印迹检测NOTUM蛋白及-catenin蛋白的表达量,使用SPSS进行相关性分析确定NOTUM蛋白与-catenin蛋白之间的关系，确定胃癌发展情况。,检测基因产物表达及水平,检测病毒感染有两个应用方向：疾病诊断与血液筛选。,疾病诊断例：风疹病毒()能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质、预防后天及再感染具有重要意义。目前临床上所用的ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原,特异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白,以指导临床应用。,检测病毒感染,01,02,03,蛋白质双向电泳应用,作用,01,02,THANKS,LOREM IPSUM,