单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测,包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测,1,主要内容,检测背景,铜绿假单胞菌的,致病性,铜绿假单胞菌的检测,主要内容检测背景,2,目前空气、河流、土壤污染严重，每年有260万人死于癌症。,云南铬矿、湖南镉大米、宿迁儿童血铅超标，大运河的水质与二十年前也没法相比,污染的严重，使人们渴望喝到干净的水，越多的人开始选择瓶装水。,一、检测背景,目前空气、河流、土壤污染严重，每年有260万人死于癌症。一、,3,国内污染情况：,-,瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率,1.223.6；,-瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率,11.6。,国外污染情况：,-,Richards等在104件检品中的,4件,分离到铜绿假单胞菌；,-Rosenberg报告德国,1.210.2,的瓶装矿泉水检出铜绿假单胞菌。,一、检测背景,一、检测背景,4,WHO,在,HACCP,的评估中明确指出铜绿假单胞菌是,婴儿,瓶装,饮用水的,危害指示菌,，可造成婴儿腹泻。,尤其是抵抗力较差的,老弱病幼孕,人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生,。,普通人,食入,10,3,10,4,个菌体细胞即可被侵害。,一、检测背景,一、检测背景,5,2014,年新出台的食品安全国家标准,GB19298-2014,包装饮用水,其中微生物指标中：,删除,了菌落总数指标；,保留,了大肠菌群；,增加,了铜绿假单胞菌这一指标。,国,家,标准,要求,：,0,CFU/250ml,一、检测背景,2014年新出台的食品安全国家标准一、检测背景,6,二、铜绿假单胞菌的,致病性,铜绿假单胞菌为,条件致病菌,，是医院内感染的主要病原菌之一。,可引起局部化脓性,炎症,，也可引起中耳炎、,角膜,炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎，,还可引起败血症菌血症及婴儿流行性腹泻,。,二、铜绿假单胞菌的致病性 铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医,7,患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者或术后治疗的患者易感染本菌。,烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。,主要致病物质是,内毒素,，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和,外毒素,等多种致病因子。,食品中铜绿假单胞菌检测课件,8,铜绿假单胞菌（,P.aeruginosa,）俗称,绿脓杆菌,，因为在代谢过程中产生,水溶性的绿色色素,，使,伤口与创面呈绿色,，故名,绿脓杆菌,。,铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为,9,无芽孢，无夹膜，,革兰氏,染色后为,红色，,革兰阴性,杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.51m1.53.0m，菌体,笔直或弯曲,。,铜绿假单胞菌的,菌体形态,无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色，革兰,10,三、铜绿假单胞菌的检测,（一）检测方法（滤膜法）,（二）检测原理,（三）试剂和设备,（四）检测步骤,（五）报告,三、铜绿假单胞菌的检测（一）检测方法（滤膜法）,11,（一）,铜绿假单胞菌检测,方法（滤膜法）,GB/T 8538-2008,饮用天然矿泉水检验方法,（一）铜绿假单胞菌检测方法（滤膜法）,12,铜绿假单胞菌的特性：,需氧菌，营养要求不高，,产色素,(,主要为绿脓素,),90 以上的菌株产生,蓝绿色色素,。,98 菌株产生,水溶性荧光色素,。,氧化酶,试验呈,阳性。,分解乙酰胺产生氨。,（二）检测原理,（二）检测原理,13,将250mL水样用孔径为0.45m的滤膜过滤，,并将滤膜移至,CN,琼脂选择性培养基上,，于36士,1恒温箱中培养48h，,典型,菌落,能够在CN琼脂,选择,性培养基,上生长并产生,绿脓菌素,，或者能够在CN琼,脂,选择性培养基,上生长并且,氧化酶呈阳性,、,紫外光,（36020nm）,照射下能,产生,荧光,、能够利用,乙酰,胺产氨,的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假,单胞菌，则其检测结果为,阳性,。,（二）检测原理,将250mL水样用孔径为0.45m的滤膜过,14,假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂,营养琼脂,金氏B 培养基,乙酰胺肉汤,氧化酶试剂,钠氏试剂,（三）试剂和设备,假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（三）试剂和设备,15,1,、检测试剂,1、检测试剂,16,1,、检测试剂,1、检测试剂,17,2,、检测材料,2、检测材料,18,2,、检测材料,2、检测材料,19,玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高压蒸汽灭菌15,min,恒温培养箱：361,紫外灯：波长应为,36020nm,滤膜：直径47mm，微孔径为,0.45,显微镜：10100,冰箱：08,3,、,设备和仪器,玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高压蒸汽灭菌15min,20,（四）检测步骤,检验程序,水样过滤,培养,结果观察,确证性试验,计数,结果报告,（四）检测步骤检验程序,21,蓝,/,绿色菌落,铜绿假单胞菌阳性,铜绿假单胞菌阳性,铜绿假单胞菌阳性,红褐色菌落,1.,检验程序,蓝/绿色菌落铜绿假单胞菌阳性铜绿假单胞菌阳性铜绿假单胞菌阳性,22,在100级的洁净工作台进行过滤操作。,首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，,将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，,固定好滤器，将,250mL,水样或稀释液通,过孔径,0.45m,的滤膜过滤，然后将过滤,后的滤膜贴在已制备好的,CN琼脂平板,上，,平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着,气泡。,2,、,水样过滤,在100级的洁净工作台进行过滤操作。2、水样过滤,23,水样过滤,水样过滤,24,3.,培养,将平板置于,36士,1恒温箱中培养,48h,，,并防止干燥。,3.培养将平板置于36士,25,培养20h24h观察滤膜上菌落的生长,情况并计数，防止因为培养导致菌落过分,生长而出现,菌落融合,。,（40h48h时更容易观察产色素情况和荧光情况）。,4,、结果观察,培养20h24h观察滤膜上菌落的生长4、结果观察,26,ATCC27853,阳性对照菌株结果观察,24h,培养结果（阳性）,ATCC27853阳性对照菌株结果观察24h培养结果（阳性）,27,ATCC25922,阴性对照菌株结果观察,24h,培养结果（阴性）,ATCC25922阴性对照菌株结果观察24h培养结果（阴性）,28,ATCC27853,阳性对照菌株结果观察,48h,培养结果（阳性）菌落融合,ATCC27853阳性对照菌株结果观察48h培养结果（阳性）,29,ATCC25922,阴性对照菌株结果观察,48h,培养结果（阴性）,ATCC25922阴性对照菌株结果观察48h培养结果（阴性）,30,在,CN,琼脂上生长的菌落选择和验证步骤,备注：,NT,表示不用测试。,在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤备注：NT表示不用测试。,31,荧光观察,紫外光（36020nm）,进行,照射,荧光观察紫外光（36020nm）进行照射,32,5.,确证性试验,（,1,）营养琼脂纯化,（,2,）氧化酶试验,（,3,）金氏,B,培养,（,4,）产氨试验,5.确证性试验（1）营养琼脂纯化,33,（,1,）,营养琼脂纯化,将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基,上,，于361培养 20h24h，,对可疑菌落进行纯化,。,（1）营养琼脂纯化,34,（,2,）氧化酶试验,将最初,显红褐色,的菌落进行,氧化酶试验,，,取,23滴,新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的,洁净滤纸,上。用铂金丝,接种环或玻璃棒,，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显,深蓝紫色,的视为阳性反应。,阴性,阳性,（2）氧化酶试验将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验，取23,35,（,3,）金氏,B,培养,将纯化后呈红褐色的且,氧化酶反应呈阳性,的培养物接种于金氏,B,培养基上于,361培养 2,4,h,5d,。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将,5d,内产生荧光的菌落,记录为阳性。,（3）金氏B培养将纯化后呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物,36,（,3,）金氏,B,培养,日光下观察,荧光下观察,阳性,阴性,阳性,阴性,（3）金氏B培养日光下观察荧光下观察阳性阴性阳性阴性,37,（,4,）产氨试验,将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在361下培养20h24h。然后向每支试管培养物加入12滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从,深黄色到砖红色,的颜色变化，则为,阳性结果,，否则为阴性。,（4）产氨试验将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36,38,（,4,）产氨试验,未加入钠氏试剂,阳性,加入钠氏试剂,阴性,阴性,阳性,阴性,深黄色,到,砖红色,（4）产氨试验未加入钠氏试剂阳性加入钠氏试剂阴性阴性阳性阴性,39,6.,计数,计数,滤膜上,产,绿脓色素,的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量。,在,紫外灯下产生荧光,且在,乙酰胺肉汤,中,产氨,的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。,将,氧化酶反应阳性,、,乙酰胺肉汤,产氨,、,金氏,B,培养基上显荧光,的红褐色菌落进行计数。,6.计数 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌的,40,菌落计数公式：,NPF(,C,F,/n,F,)R(,C,R,/n,R,),P,呈蓝/绿色的菌落数,；,F,没有绿脓色素但显荧光的菌落数,；,R,呈红褐色的菌落数,；,n,F,进行产氨测试的显荧光菌落数,；,C,F,产氨阳性的显荧光菌落数,；,n,R,进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数,；,C,R,产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。,7.,结果说明,菌落计数公式：7.结果说明,41,计算,举 例,N=,20,+1,5,(2/,5,)+10(3/,5,),=32,20,：呈蓝/绿色的菌落数；,15,：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；,2：产氨阳性的显荧光菌落数；,5,：进行产氨测试的显荧光菌落数；,10：呈红褐色的菌落数；,3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；,5：,进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。,计算举 例,42,结果以,CFU/250ml,计。,国,家,标准,要求,：,0,CFU/250ml,注意,：,若样品污染严重，建议对样品进行稀释，如,10倍递增稀释,：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。,（五）报告,（五）报告,43,铜绿假单胞菌虽然可由多种途径传播,，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起,医源性感染,。,1,：,2000,的,新洁尔灭,，,1,：,5000,的,消毒净,在,5,分钟内均可将其杀死。,0.5-1%,醋酸,也可迅速使其死亡。,青霉素,对此菌无效。,因此，医院对烧伤病房、手术器械及治疗器械进行严格消毒灭菌，可保证无铜绿假单胞菌的污染,。,铜绿假单胞菌虽然可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、,44,一般情况下，铜绿假单胞菌经过水源水消毒、管道消毒和臭氧消毒后，其活力大大降低，基本检测不出铜绿假单胞菌。,福建某市桶装天然矿泉水铜绿假单胞菌超标，到处查找原因，最后发现是蓄水池水（原始污染源）中含有大量铜绿假单胞菌。停用了蓄水池的水，产品结果变正常。,如发现污染，请查找污染源，消除污染。,一般情况下，铜绿假单胞菌经过水源水消毒、管道消毒和臭氧消毒后,45,课堂测验,1.GB19298-2014,包装饮用水,的微生物指标中，增加了,的检测，删除了,的检测。,A.,菌落总数,B.,大肠菌群,C.,铜绿假单胞菌,D.,霉菌,2.,铜绿假单胞菌,可引起局部化脓性炎症，也可引起,。,A.,中耳炎,B.,角膜炎,C.,胃肠炎,D.,以上都是,3.,下列,不是铜绿假单胞菌的检测试剂。,A.CN,琼脂,B.,乙酰胺肉汤,C.,氧化酶试剂,D.,革兰氏染色剂,课堂测验1.GB19298-2014包装饮用水的微生物,46,4.,铜绿假单胞菌检测中可计数的菌落包括,。,A.,蓝绿色菌落,B.,产荧光（非蓝绿色），乙酰胺肉汤阳性菌落,C.,红