单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,Western blot,实验技术,牛君星,1,ppt课件,Western blot 实验技术牛君星1ppt课件,定义：,印迹法（,blotting,）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,Western Blot,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。,1975,年，,Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定的,DNA,片段的方法，称为,Southern,印迹法。,而后人们用类似的方法，对,RNA,和蛋白质进行印迹分析，对,RNA,的印迹分析称为,Northern,印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为,Western,印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为,Eastern,印迹法,2,ppt课件,定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，,Western Blot,基本原理,Western Blot,：,采用的是,聚丙烯酰胺凝胶电泳,，被检测物 是,蛋白质,，,“,探针,”,是,抗体,，,“,显色,”,用,标记的二抗,。,经过,PAGE,分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,3,ppt课件,Western Blot基本原理 3ppt课件,Western Blot,一般流程,蛋白样品的制备,SDS,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,电泳,转膜,封闭,一抗杂交,洗涤,二抗杂交,洗涤,底物显色,4,ppt课件,Western Blot一般流程蛋白样品的制备 电泳4ppt,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白,水溶液提取法,针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液,对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。,细胞裂解液,：,0.5ml,水,+0.5ml,裂解液,+10,l,蛋白酶抑制剂,+,10,l,泛酸钠,+,1,l pepstain,有机溶剂提取法,对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、,丙酮和丁醇等。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的制备,5,ppt课件,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白蛋白样品的制备5ppt课件,细胞数量达,510,6,个时就可以做,WB,。,将细胞裂解液再离心，收集上清液，加,loading,煮样,5min,蛋白样品制备的注意事项：,煮沸,5-15min,，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在,70,0,C,加热,5-10min,，尤其适用于,多次跨膜蛋白,的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。）,6,ppt课件,细胞数量达5106个时就可以做WB。蛋白样品制备的注意事项,纯净水（,ddH,2,O,）,丙烯酰胺和,N,N-,亚甲双丙烯酰胺,（,Arc-Bis,）。,30%,（,29:1,）,SDS,（,10%,）,Tris-HCL,四甲基乙二胺,(TEMED),（,催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合,）,过硫酸铵,(APS),（,提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基,）,凝胶成份,7,ppt课件,纯净水（ddH2O）凝胶成份7ppt课件,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：,做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶,(,水封、插梳子和拔梳子,),。,加样：两边加,loading,，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散,电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳,buffer,（内外面不能联通），将电压调到,90V,开始电泳，待,marker,开始分离时将电压调到,120V,，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。,8,ppt课件,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：做胶：防止漏胶、进气泡以及,膜的选择,9,ppt课件,膜的选择9ppt课件,转膜注意事项（一）,泡膜：,转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移,buffer,浸泡,20min,（,1.,凝胶,若是没在预冷的转膜,buffer,中浸泡，就会在转膜过程中出现,凝胶皱缩,，导致出现,转移条带变形,。,2.PVDF,膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）,转膜顺序：,阴极碳板,+,海绵,+,三滤,+,胶,+,膜,+,三滤,+,海绵,+,阳极碳板,转膜条件：,0.35A 250V 1h40min,冰浴,中进行转膜,（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）,10,ppt课件,转膜注意事项（一）10ppt课件,转膜的注意事项（二）,避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。,夹好膜和凝胶后，确定在凝胶,/,膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。,保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。,鸡来源的抗体与,PVDF,和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（,NC,膜）。,11,ppt课件,转膜的注意事项（二）避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上,封闭（,30min,）,(,封闭时间过短会导致背景过深,),5,脱脂奶粉,（,如果用,生物素,标记的二抗，就不能用奶粉封闭，因为奶粉中含有生物素,）,BSA,（牛血清蛋白）,Western Blot,膜封闭液（谷歌生物提供）,12,ppt课件,封闭（30min）(封闭时间过短会导致背景过深)5脱脂奶,一抗、二抗孵育,加入一抗溶液孵育,（,抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性,）,。,4,时过夜。,回收一抗溶液，用,TBST,洗膜,3,次，每次,5min,（,洗涤不充分会导致膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确,）,。,加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动，室温,25min,。,回收二抗，,TBST,洗膜,3,次，每次,5min,。,短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。,Tween,有助于去除非特异性的结合，减少背景。,13,ppt课件,一抗、二抗孵育加入一抗溶液孵育（抗体浓度过高会导致背景较深，,显色反应,注意：,发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底，,影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。,14,ppt课件,显色反应注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致,关于磷酸化蛋白检测的注意事项：,保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的,磷酸酶抑制剂,（,NaF,，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！,使用,5%,的,BSA,作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉,!,（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。）,15,ppt课件,关于磷酸化蛋白检测的注意事项：保持待测蛋白处于磷酸化状态！在,抗体保存注意事项：,1.,收到抗体后,按要求离心后再打开管盖,进行分装和保存！,2.,对于大部分抗体，比较合适的保存方式是,分装后保存在,-20,0,C,。,2.1,分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于,10ul,每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。,2.2,复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在,4,0,C,，避免再冻起来！,2.3,绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。,3.,大部分抗体收到后,4,0,C,短暂保存,1-2,周,对抗体活性是没有影响的。,4.,长期保存，加入,叠氮纳,，防止细菌污染,任何时候，绝对避免反复冻融！,16,ppt课件,抗体保存注意事项：1.收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分,Western Blot,常见问题分析,17,ppt课件,Western Blot常见问题分析17ppt课件,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,APS,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,18,ppt课件,SDS-PAGE电泳胶不平？胶板洗刷干净18ppt课件,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，且竖直的拔,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,19,ppt课件,条带比正常的窄？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，,“,三明治,”,结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸,确保膜和胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,20,ppt课件,转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲,背景太高,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原因,对,策,转膜前用转移缓冲液将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,21,ppt课件,背景太高膜没有均匀浸湿 原因对转膜前用转移缓冲液将膜完全浸湿,