,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,第五节 基因扩增技术,第五节 基因扩增技术,一、,PCR,的定义：,PCR,（,polymerase chain reaction),：,聚合酶链式反应，又称体外,DNA,扩增技术。,近年来发展起来的一种体外扩增特异,DNA,片段的技术。,一、PCR的定义：,PCR,技术：,1985,年由美国,Cetus,公司的,Kary Mullis,首创，可以将微量目的,DNA,片段扩增一百万倍以上。,优点：,敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便,等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。,Kary Mullis,本人因此获,1993,年诺贝尔化学奖。,PCR技术：1985年由美国 Cetus 公司的,二、,PCR,技术的原理,1.,变性,(Denaturation),：,加热使模板,DNA,双链间的氢键断裂而形成两条单链。,95,2.,退火,(,复性,),(Annealling):,降低反应体系的温度使寡核苷酸,引物,与,DNA,模板,互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。,55,也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。,二、PCR技术的原理,3.,延伸,(Extension):,升高反应体系温度至,72,，以,4,种,dNTP,为原料，在,DNA,聚合酶作用下，从引物的,3-OH,端延伸，以变性后的单链,DNA,为模板，合成出,5,3,的互补链。,上述,3,步为一个循环，每经过一个循环，样本中的,DNA,量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过,25,40,个循环后,DNA,可扩增,10,6,10,9,倍。,3.延伸(Extension):,PCR,的基本反应步骤,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-55C,PCR 的基本反应步骤变性延伸退火,双链,DNA,分子,双链DNA分子,双链断开,循环,1,双链断开循环1,模板与引物结合,循环,1,模板与引物结合循环1,循环,1,Taq,Taq,循环1TaqTaq,循环,1,循环1,双链断开,循环,2,双链断开循环2,模板与引物结合,循环,2,模板与引物结合循环2,循环,2,循环2,PCR,循环次数与,DNA,产量关系,理论上，终产物DNA的量可用Y,n,=X2,n,计算,但在实际扩增过程中，扩增效率不可能达到100%,Y,n,=X（1+E）,n,0,E1,PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Y,四、,PCR,的反应体系,1.,模板,DNA,：,被复制的核酸片段，在用,RNA,作模板时，须先将,RNA,逆转录为,cDNA,，再以,cDNA,作为,PCR,反应的模板进行扩增反应。,2.,引物：,为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板有两条引物，其,决定着,PCR,扩增产物的特异性和长度。,四、PCR的反应体系,3.,脱氧核苷三磷酸（,dNTP,）：,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,浓度为,0.02,0.2 mmol/L,4.,Taq DNA,聚合酶：,催化,DNA,的合成,0.5,5 U/100 l,，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：产物量降低,3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：,5.MgCl,2,:,1.5,2.0,mmol/L,Taq,酶具有,Mg,2+,依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量,过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。,5.MgCl2:,6.,缓冲液：,10,50,mmol/L Tris-Cl(pH8.4),维持,Taq,酶作用环境的偏碱性,25,50 mmol/L KCl,促进引物退火，,50,mmol/L,会抑制,Taq,酶的活性。,100g/ml,牛血清白蛋白,(BSA),对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作,用，建议使用乙酰化的,BSA,。,6.缓冲液：,五、注意事项,1.,实验室的布局要求：,生物安全二级实验室,保护操作人员,保护环境,保护样品,五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作,临床,PCR,实验室分区,试剂储存和准备区,标本制备区,扩增反应区,产物分析区,临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应,PCR,实验室,平面设计,在入口处设,缓冲间缓冲间比专用走廊更有意义。,PCR实验室平面设计在入口处设缓冲间缓冲间比专用走廊更有,PCR技术-基因扩增技术-课件,PCR技术-基因扩增技术-课件,PCR,实验室各区的设备配置表,PCR实验室各区的设备配置表,2.,操作人员必须进行上岗培训：,卫生部临床检验中心或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临床检验中心认定的机构,3.,分装试剂：,在超净工作台内分装，然后低温保存,4.,实验操作注意事项：,做好个人防护,避免反应液飞溅,2.操作人员必须进行上岗培训：,4.,实验操作注意事项：,应有完整、有效的去污措施,实验前,：实验耗材（反应管、加样器吸头）必须经高压消毒,实验后,：反应管、加样器吸头用,10%,次氯酸钠溶液消毒处理；实验台面和其他表面用,10%,次氯酸钠溶液或紫外线近距离照射,4.实验操作注意事项：应有完整、有效的去污措施,4.,实验操作注意事项：,设立阴性、阳性对照,阴性对照：检查是否存在污染,阳性对照：证明实验体系正常，防止假阴性,4.实验操作注意事项：设立阴性、阳性对照,