单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物激素的酶连免疫分析法,DNM-9602G,酶标分析仪,DNM-9602,标配酶标分析仪,DNM-9602A,酶标分析仪,几种酶标分析仪,操 作 步 骤,包被,-,温育,-,洗涤,-,竞争,-,温育,-,洗涤,-,加二抗,-,温育,-,洗涤,-,显色,-,比色,-,计算,包 被,每小孔中加入,100,l,包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。,37,下,1.5,小时。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第,2,次。共洗涤,3,次。,竞 争,即加标准物、待测样和抗体。,加标样及待测样：取适量所给标样稀释配成：,ABA,标准曲线的最大浓度为,100ng/ml,然后再依次,2,倍稀释,8,个浓度（包括,2,个,0ng/ml,，加入前两行的最后两排）。将系列标准样加入,96,孔酶标板的,1,、,2,、,3,行，每个浓度加,3,孔，每孔,50l,其余孔加待测样，每个样品重复,3,孔，每孔,50l,。,加 抗 体,在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加,50l,，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。,竞争条件,37,左右,0.5h,。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第,2,次。共洗涤,3,次。,加“二抗”,将适当的酶标二抗，加入,10ml,样品稀释液中（比如稀释倍数,1:1000,就加,10l,），混匀后，在酶标板每孔加,100l,，然后将其放入湿盒内，置,37,下，温育,0.5h,。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第,2,次。共洗涤,3,次。,加底物显色,在每孔中加,100l,邻苯二胺（,OPD,）溶液（小心勿用手接触,OPD,），（每,10ml,溶液中含,4l 30%H202,。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且,100ng/ml,孔颜色还较浅），每孔加入,50l 2mol/L,硫酸终止反应。,比 色,在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品,490nm,处的,OD,值。,用酶标仪进行比色，以,0,ng,/ml,标准孔为空白孔，在波长,450nm,处分别读取各标准孔和样本孔,OD,值，以,OD,值为横坐标，“标样,激素,含量的,对数,”为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的,OD,值在标准曲线上查出待测样品的,ABA,含量的对数。利用,反对数,求得,ABA,的绝对含量。,数 据 分 析,植物激素的测定方法？,生物活性法,气相色谱（气,-,质联机）,液相色谱（液,-,质联机）,酶连免疫法（,ELISA,法）,问题：我们该选择哪种板呢？,ELISA,技术的特点与局限性,（,1,）,ELISA,特点：在固相表面组装免疫活性物质形成,免疫吸附剂,；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。,（,2,）,ELISA,局限性：只能检测到,ng,水平，精密度差（批内,CV15-20%,）；,线性范围窄（一个数量级）。,注意事项,：,（,1,）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应。,（,2,）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。,（,3,）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。,（,4,）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差。,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA,),原理,（以间接性,ELISA,为例）,：,显色,抗 原,医学上重要的抗原,伤寒杆菌,链球菌,痢疾杆菌,流感病毒,口蹄疫病毒,狂犬病病毒,抗原的概述,抗原（,Ag,）是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内、外发生特异性反应的物质,抗原的两个基本特性,免疫原性（,immunogenicity,),免疫反应性,(,immunoreactivity,),完全抗原,(complete antigen),半抗原,(,hapten,),载体,(carrier),半抗原,+,载体,抗体,B,T,完全抗原,B,B,B,T,抗体（,Ab,）,抗体（,antibody,Ab,),是,B,细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。,免疫球蛋白（,Immunoglobulin,，,Ig,）,是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,一、基本概念：,二、免疫球蛋白的分子结构,免疫球蛋白的基本结构,四肽链结构,，链间二硫键连接,两条重链（,H,）,和两条轻链（,L,）,氨基端和羧基端,。,根据氨基酸排列顺序的不同分为：,可变区（,V,）,和恒定区（,C,）,可变区（,V,区）：,氨基酸组成、排列顺序变化较大,恒定区（,C,区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定,可变区与恒定区,单克隆和多克隆抗体的比较和用途,特异性,敏感性,均一性,McAb,PcAb,低,差,无,高,强,有,1,、用于免疫学检测，辅助临床诊断,2,、,McAb,用于亲和层析，分离微量可溶性抗原,3,、标记的,McAb,用于基础研究，了解细胞分化等,4,、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。,多克隆抗体,：多个抗原决定基机体多种抗体的混合物,单克隆抗体（,monoclonal antibody,mAb,）,：由一个,B,细胞克隆产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体,基因工程抗体,六、人工制备的抗体,用,标记物标记抗体或抗原,进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素：,异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）,放射性同位素：,125,I,、,131,I,酶：,辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶,免疫荧光检测法（,IFA,）,放射免疫检测法（,RIA,）,酶免疫检测法（,EIA,）,液相（,ELISA,）、,固相（免疫组化技术）,间接,ELISA,双抗夹心法,酶联免疫吸附试验（,e,nzyme,l,inked,i,mmuno,s,orbent,a,ssay,ELISA,法,）,