单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,仪器分析实验,黄酮含量的测定,吸光光度法,是基于被测物质的,分子,对,光,具有,选择吸收,的特性而建立的分析方法。,光的,电磁波性质,射线,x,射线,紫外光,红外光,微波,无线电波,10,-2,nm 10 nm 10,2,nm 10,4,nm 0.1 cm 10cm 10,3,cm 10,5,cm,可 见 光,一、物质对光的吸收与吸收光谱,光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的 性质及光的性质有关。,物质对光的吸收,物质对光的吸收满足,Plank,条件,h,S,2,S,1,S,0,S,3,E,2,E,0,E,1,E,3,h,h,h,吸收光谱,Absorption Spectrum,纯,电子能态,间跃迁,S,2,S,1,S,0,S,3,h,E,2,E,0,E,1,E,3,S,2,S,1,S,0,h,A,h,h,h,分子内电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,A,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收,A,B,A,在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,A,C,增大,二、溶液的吸光定律,透光率,（透射比）,透光率定义：,T,取值为,0.0%100.0%,全部吸收,T=0.0%,全部透射,T=100.0%,入射光,I,0,透射光,I,t,Lambert Beer Law:,K,：,吸光系数,入射光波长,物质的性质,温度,吸收定律与吸收光谱的关系,A,C,吸光定律,A,或,吸收光谱,A,C,max,吸光度的加合性,多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即,对,吸收定律偏离,A,C,主要原因,非,单色光,吸光质点的相互作用,三、吸光分析仪的基本构造,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I,0,I,t,参比,样品,入射光,I,0,透射光,I,t,请,注意与定义比较,未,考虑吸收池和溶剂对光子的作用,单波长单光束分光光度计,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,单,波长双光束分光光度计,比值,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,光束分裂器,实验二 黄酮类物质含量的测定,一 原理提要,黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有,4,位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的,3,羟基、,4,羟基或,5,羟基、,4,羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。,本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于,510nm,波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。,3,操作步骤,（,1,）样品处理,1,）固体样品：,称取,1,2g,干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器,中，加入,50,100ml70,乙醇溶液浸润后，在,80,水浴下回流,3h,，至提取液无色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量,25,乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在,50,下减压蒸馏，除去,其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶,液，用,30ml,热水分,3,次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗,中，以,75ml,氯仿分,3,次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下,层水溶液并定容至,50ml,。,2,）液体样品：,准确吸取,1.0ml,样品，定容至,50ml,后，直接以,75ml,氯仿分,3,次萃取脱脂，其余步骤同上。,（,2,）标准曲线的绘制：,准确吸取芦丁标准溶液,0,、,0.50,、,1.00,、,2.00,、,3.00,、,00ml,（相当于芦丁,0,、,75,、,150,、,300,、,450,、,600ug,），移入,10ml,刻度比色管中，加入,30,乙醇溶,液至,5ml,，各加,5,亚硝酸钠溶液,0.3ml,，振摇后放置,5min,，加入,10,硝酸铝溶液,0.3ml,摇匀后放置,6min,，加,1.0mol,L,氢氧化钠溶液,2ml,，用,30,乙醇,定容至刻度。摇匀，放置,15min,，于,510nm,波长处测,定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（,ug,）为横,坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关,系数（,r,）。,（,3,）样品测定：,根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测,液，按标准曲线制备操作步骤于,510nm,处进行吸光度,的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。,4.,结果计算,根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦,丁含量。,