单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/6/15,0,血流感染的早期诊断与病原菌识别,1,血流感染的早期诊断与病原菌识别1,01,02,03,04,血流感染的定义、诊断及流行病学,早期诊断与病原菌识别的方法,-血培养相关问题,早期诊断与病原菌识别,-,感染标志物相关问题,早期诊断与病原菌识别,-,分子生物学检测相关问题,目 录,2,01020304 血流感染的定义、诊断及流行病学 早期诊断与,血流感染定义（BSI）,败血症（,septicemia,）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染性疾病，病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。,菌血症（,bacteremia,）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。,血流感染（,bloodstream infection,BSI,）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。,3,血流感染定义（BSI）败血症（septicemia）：病原菌,血流感染的诊断标准（,2001年卫生部颁布,）,4,血流感染的诊断标准（2001年卫生部颁布）4,血流感染诊断标准（1996美国疾病控制与预防中心）,血培养 1 次或 1 次以上阳性,阳性病原体与其他感染部位无关。,患者至少有以下 1 项症状或体征:发热(38 )、寒战或低血压,同时,至少满足以下,任意 1 项,:,若血培养为常见的皮肤寄植菌需有不同时间 2 次或 2 次以上的血培养阳性。,若血培养为上述常见皮肤寄植菌,血培养仅 1 次阳性则需同时有静脉导管培养为阳性的同一病原菌且已开始正确的抗微生物治疗。,血抗原测定阳性,且症状、体征、实验室结果不能用其他部位的感染来解释,5,血流感染诊断标准（1996美国疾病控制与预防中心）血培养,血流感染流行病学资料,全球：,1800,万病例,美国：确诊病例,130,万,欧洲和日本：确诊病例,190,万,每年治疗费用：,167,亿美金美国,67,亿美金欧洲,导致死亡病种排名第十位,每年导致大约,40,万人死亡,败血症在,10,年间增加了,139,非心内,ICU,病区最常见的死亡病因,在,130,万病例中，有,78,万例发生在,ICU,病区,Crit Care Med 2001;29:1303-10,6,血流感染流行病学资料 导致死亡病种排名第十位Crit Ca,国内血流感染的病死率,结论：普通住院患者,BSI,的病死率为,20.7%,，烧伤、血液病肿瘤以及,ICU,患者病死率更高，而新生儿病房、肝病及糖尿病患者则相对较低。医院,BSI,病死率为,26.8%,，明显高于社区,BSI,的病死率。近几十年来，,BSI,住院病死率呈下降趋势。,7,国内血流感染的病死率结论：普通住院患者BSI的病死率为20.,病死率,临床表现,血培养,治疗问题,血流感染病情凶险，死亡率高达,26-41%,阳性率低，培养结果所需时间长（,2-5,天）,临床表现缺乏特异性，诊断困难,不恰当的经验性治疗易导致细菌耐药及医疗资源浪费,血流感染早期诊断治疗存在的问题,8,病死率临床表现血培养治疗问题 血流感染病情凶险，死亡率,早期诊断与病原菌识别的主要方法,快速检测方法，包括原位分子杂交、聚合酶链反应、基因芯片、质谱技术等,针对免疫和炎症反应的指标;包括,TNF-a、PCT、IL-6、CRP、乳酸及内毒素等，特异性差,血培养,分子生物学检测,感染标志物检测,血流感染诊断的金标准，但阳性率低，检测周期长（,3-7,天）,9,早期诊断与病原菌识别的主要方法 快速检测方法，包,血流感染的血培养方法,临床细菌,/,真菌检测常用的方法,生化表型,全自动微生物鉴定,/,药敏分析系统,10,血流感染的血培养方法临床细菌/真菌检测常用的方法生化表型全自,血培养研究,对,2004,年,1,月,-2005,年,12,月入住,Robert Wood Johnson,大学附属医院及,Duke,大学医疗中心且血培养阳性的成人患者进行回顾性分析，患者在,24h,内均接受,3,次血培养,研究旨在评估血培养次数与阳性率的相关性,Lee A et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):35463548,11,血培养研究 对2004年1月-2005年12月入住Rober,单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率,24,小时血培养次数,3,次或,4,次的患者，前两次血培养的阳性率,99%,阳性率,Lee A et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):35463548,12,单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率24小时血培养次数3,混合感染：多次血培养可提高阳性率,研究期间，共发生,58,例由多种病原体导致的血流感染，该类患者前三次血培养的阳性率为,100%,阳性率,N=58,例,Lee A et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):35463548,13,混合感染：多次血培养可提高阳性率研究期间，共发生58例由多种,病原体血培养的阳性率与采血体积相关,导致血流感染的,G,-,菌、,G,+,菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关,阳性率,标准体积：采血量为,7-10ml,平均,8.7ml;,低体积：采血量,2.455,微克,/L,诊断G,-,菌,BSI,的敏感度为,71.4%,，特异度,96.2%。,在G+菌血流感染所致脓毒症患者，PCT的AUC为0.619，最佳诊断临界值1.585,微克,/L,敏感度41.2、特异度82,诊断细菌性,BSI,时，血浆PCT的敏感性和特异性较血清CRP、血浆内毒素明显增高,结论,：G,-,菌血流感染所致脓毒症患者PCT、CRP、内毒素水平高于G+菌血流感染者，三者联合检测有望成为早期判断血流感染所致脓毒症及其病情严重程度的指标。,23,不同感染标志物的诊断价值-2结果显示结论：G-菌血流感染,分子生物学指标监测,聚合酶链反应（,PCR,）,荧光原位杂交技术,基因芯片技术,质谱技术,24,分子生物学指标监测聚合酶链反应（PCR）荧光原位杂交技术基因,一、荧光原位杂交技术（,FISH,）,核酸杂交技术,核酸杂交是指具有一定互补序列的,2,条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形成同源或异源双链分子的过程。核酸杂交可在,DNA,与,DNA,、,RNA,与,RNA,或,RNA,与,DNA,的,2,条条单链之间进行。其中，,荧光原位杂交技术（,FISH,）,应用于临床实验室鉴定工作已有,10,余年，其检测的敏感性和特异性可达到,96-100%,25,一、荧光原位杂交技术（FISH）核酸杂交技术核酸杂交是指具,血培养阳性,PNA FISH,核酸荧光原位杂交,血培养阳性肉汤 革兰染色,PNA FISH,革兰阴性菌：,商品化试剂盒,eco/kpn/pae,Efa/,其它肠球,Sau/scn,Cal/cgl/,其它念珠菌,报道,Salmonella spp.,90min PNA FISH,完成,Appl Environ Microbiol.2010;76:4476,J.Clin.Microbiol.2013,51(4):1301,J Clin Microbiol.2009;47:247,26,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交血培养阳性肉汤,荧光原位杂交技术,-,细菌,早期识别,新的荧光原位杂交技术对血培养阳性快速病原体识别,结果显示,：,152,例患者,血培养阳性的个标本中，,FISH,鉴定细菌生长的阳性例标本数,145,个。在病原菌鉴别中,138,例准确，,7,例错误，微生物识别准确率,95.2%,可信区间,95%,。在需氧菌和厌氧菌的鉴别没有差异。对血培养阳性病原菌鉴别时间为,30,分钟，上机时间仅需,10,分钟。,结论：荧光原位杂交技术对于血流感染的快速诊断和病原菌精确识别具有重要的临床意义,27,荧光原位杂交技术-细菌早期识别新的荧光原位杂交技术对血培养阳,荧光原位杂交技术,-,真菌,早期识别,对照性研究,通过对疑似侵袭性真菌感染患者血培养和脑脊液中病原体的检测，,以评价,FISH,技术的诊断价值。,28,荧光原位杂交技术-真菌早期识别对照性研究28,荧光原位杂交技术,-,真菌,早期识别,在,112,份脑脊液标本中，,FISH,检测真菌的阳性率稍高于传统墨汁染色显微镜检测值（,48/46,），且阳性结果敏感性和特异性均为,100%,。,对血标本中病原菌的鉴别能力传统方法、,PCR-RFLP,及,FISH,没有差异（,14/30,）,血培养确定微生物生长后进行病原菌识别的平均时间有明显差异，传统显微镜识别、,PCR-RFLP,及,FISH,分别为,6,天、,12,小时和,5,小时,结论：荧光原位杂交技术在侵袭性真菌感染的病原菌识别方面具有重要价值,29,荧光原位杂交技术-真菌早期识别在112份脑脊液标本中，F,二、基因芯片技术,基因芯片,(gene chip),基因芯片也称,DNA,微阵列，可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片检测,基本原理,是将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测,DNA,标本进行杂交反应，从而获得需要的生物学信息。,液相基因芯片是近年来发展出的一种新的芯片技术，与固相芯片相比，液相芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性,商品化基因芯片血流感染病原体检测均应用于阳性血培养物（血培养阳性病原菌鉴定）,30,二、基因芯片技术基因芯片(gene chip)基因芯片也称,结果：,标本病原菌识别率为,86%,（,1807/2017,）,，敏感率为,94.7%,（,95%CI,），特异性为,98.8%,。而对,MRSA,的特异性为,100%,。病原菌检测时间仅需,18,小时,结论：基因芯片技术对细菌种类进行最终鉴定具有较传统血培养敏感性高、特异性强及时间更短的特点。有利于临床脓毒症快速诊断和早期治疗,。,基因芯片技术对血培养阳性标本进行细菌种类准确、快速鉴定的一项观察性研究,对英国和芬兰两个医学中心,3318,例疑似脓毒症患者的,2107,份血培养阳性标本用新型的,PCR,扩增和基因芯片技术检测鉴定血标本中病原菌，并与常规的细菌培养方法对照,31,结果：标本病原菌识别率为86%（1807/2017），敏感率,三、质谱技术,质谱,(,mass spectrometry,MS),技术，尤其是,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,(,MALDI-TOF MS)，,具有简便、快速及特异地分析微生物大分子标记物质谱图，从而实现临床微生物检验中细菌、真菌及病毒在属、种、株水平上的鉴定。,MS,在菌血症、尿路感染、毒素检测及耐药监测方面显示出巨大的优势，有望成为临床微生物实验室感染性疾病常用诊断方法,弗朗西斯阿斯顿于1919年制成的第一台质谱分析仪，1922年诺贝尔化学奖,32,三、质谱技术质谱(mass spectrometry,MS),MALDI-TOF MS,操作步骤,33,MALDI-TOF MS操作步骤33,MALDI-TOF MS,快速鉴定阳性血培养,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定,快速：,20,分钟,(,从报警到鉴定出结果）,MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):,正确鉴定：,193/213,阴性菌（包括厌氧菌）,(90.61%),，,284/319,阳性菌,(89.02%),80.9%,复数菌正确鉴定出一种，,7,株缓症链球菌鉴定为,spn,MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux):,388,个阳性瓶，种正确率,91%,（包括念珠、厌氧菌）,15,瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，,6,瓶鉴定出第二种菌,Clin Microbiol