单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本章内容,一、核酸的概念与重要性,二、核酸的组成成分,三、,DNA,的结构,五、,RNA,的结构和功能,六、核酸的性质,七、核酸的序列测定,本章内容一、核酸的概念与重要性,1,核酸的性质,一般理化性质,核酸的紫外吸收性质,核酸结构的稳定性,DNA,的变性、复性与分子杂交,核酸的性质一般理化性质,2,DNA,有酸性磷酸基及碱性碱基，为两性大分子，但,偏于酸性,。,DNA,为白色纤维状固体，,RNA,为白色粉末；微溶于水，不溶于一般有机溶剂。,DNA,的粘度极高，,RNA,要小的多；,RNA,在室温被稀碱水解成核苷酸而,DNA,（因其,2,，,位没有,OH,基）对碱稳定。,D,核糖（,RNA,组分）与浓盐酸和苔黑酚共热产生,绿色,；,D,2,脱氧核糖（,DNA,组分）与酸和二苯胺共热产生,蓝紫色,，可区别二者及定量测定。,一般理化性质,DNA有酸性磷酸基及碱性碱基，为两性大分子，但偏于酸性。一般,3,核酸的紫外吸收性质,UV,吸收：,核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在,260,nm,处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。,核酸的光吸收比其各核苷酸成分的光吸收值之和要,少,30,40,，这是双螺旋中碱基紧密堆积在一起造成的。,核酸的紫外吸收性质 UV吸收：,4,核酸结构的稳定性,1,、,碱基对间的氢键,在核酸双螺旋区，碱基对间形成氢键；氢键是一种较弱的非共价键，但许多氢键的集合能量是很大的。,2,、,碱基堆积力,疏水性的碱基堆积在双螺旋内部，形成疏水核心；螺旋外围的核糖和磷酸基上的亲水基团，使环境中的水在螺旋外围形成水壳，也有助于螺旋的稳定。,3,、,环境中的正离子,环境中的正离子与核酸的带负电荷的磷酸基团结合，消除静电斥力，稳定核酸结构。,核酸结构的稳定性1、碱基对间的氢键,5,DNA,的变性、复性与分子杂交,DNA,双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释,DNA,的重要特性变性与复性。,（一）,DNA,变性,1、,DNA,变性的概念,：指,DNA,分子中的双螺旋结构解链 为,无规则线性结构,的现象。,2、,DNA,变性的本质,：维持双螺旋稳定性的,氢键断裂,，,碱基间的堆积力遭到破坏,，但不涉及到其一级结构的改变。,3、,导致,DNA,变性的因素：,凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的,pH、,有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性,DNA的变性、复性与分子杂交 DNA双螺旋结构模型，,6,4,、,变性后,DNA,其它理化性质变化：,紫外吸收增强（,OD260,增高）、粘度下降、浮,力密度升高、生物活性部分或全部丧失,增色效应,：,指,DNA,变性后其,紫外吸收明显增强的效应,。,DNA,分子中碱基间电子的相互作用使,DNA,分子具有吸收260,nm,波长紫外光的特性。在,DNA,双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时,DNA,双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。,4、变性后DNA其它理化性质变化：增色效应：,7,DNA,变性的本质是氢键的断裂,DNA变性的本质是氢键的断裂,8,对双链,DNA,进行加热变性，当温度升高到一定高度时，,DNA,溶液在260,nm,处的吸光度,突然明显上升至最高值,，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对,DNA,溶液的紫外吸光率作图，得到的典型,DNA,变性曲线呈,S,型。,对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液,9,5,、,熔解温度,(,Tm,）：,由上图可见，,DNA,变性是在一个,很窄的温度范围内,发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的,50%,时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的熔解相类似，又称,熔解温度,（一般在,80,100,）,。,在,Tm,时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。,影响因素：,（,1,）,GC,含量：,特定核酸分子的,Tm,值与其,GC,所占,总碱基数的百分比成正相关。,（,2,）,溶液的离子强度,：,离子强度较低的介质中，,Tm,较低。,（,3,）,溶液的,pH,值,：,pH,过高过低引起,DNA,变性。,（,4,）,变性剂,的使用可使,Tm,降低：,5、熔解温度(Tm）：,10,(G+C)%=,（,Tm,69.3,）,2.44,(G+C)%=（Tm 69.3）2.44,11,(二),DNA,的热变性与复性,指经加热变性的,DNA,在适当条件下，二条互补链全部或部分,恢复,到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性,DNA,一般经,缓慢冷却,后即可复性，此过程称之为,退火,。,一般认为比,Tm,低25左右的温度是复性的最佳条件。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。,影响因素：,（,1,）单链片段浓度（,2,）单链片段大小,（,3,）片段内的重复序列（,4,）溶液的离子强度,(二)DNA的热变性与复性 指经加热变性的DNA在适,12,*复性过程中的碱基配对：,*复性过程中的碱基配对：,13,（三）分子杂交：,不同来源,的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成,碱基互补配对的片段,，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的,杂化双链,，,这个过程称为,杂交,。,杂交可以发生于,DNA,与,DNA,之间，也可以发生于,RNA,与,RNA,之间和,DNA,与,RNA,之间。,核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来,检验核酸的缺失、插入,，还可用来,考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系,，其主要应用如下图所示：,（三）分子杂交：不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性,14,核酸杂交,核酸杂交,15,.,变性、复性和杂交,。粗细线分别代表不同,DNA。A,是杂化双链,.,突变体的鉴别,。,B,代表天然,DNA；C,是,B,的缺失突变体；,虚线框内是已缺失的部分；,D,是显示从天然,DNA,链鼓出小泡,.粗线代表,探针,，粗线上的,X,表示放射性标记,.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链,16,核酸的性质课件,17,核酸的性质课件,18,Sanger,双脱氧链终止法(酶法测序）,（,1,）,以,DNA,的酶促合成原理为基础,：,DNA,的合成需要模板、引物、底物（,dNTP,）、聚合酶等条件。在引物的3末端，依据碱基配对的原则，生成新的3,5磷酸二酯键，进行延伸。,（,2,）测序时，四组反应平行进行，每组反应均使用相同的模板、引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的,双脱氧核苷酸（,ddNTP,）,，使其随机地接入,DNA,链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的,DNA,链。这四组,DNA,链再经过,聚丙烯酸胺凝胶电泳,按链的长短分离开，经过,放射自显影,显示区带，就可以,直接读出被测,DNA,的核苷酸序列,如下图所示：,核酸的序列测定,Sanger双脱氧链终止法(酶法测序）（1）以DNA的酶促合,19,核酸的性质课件,20,核酸的性质课件,21,核酸的性质课件,22,