,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,制备基因工程药物的基本过程,人胰岛素的制备,制备基因工程药物的基本过程人胰岛素的制备,人胰岛素的制备-生物技术制药课件,人胰岛素的制备-生物技术制药课件,一，获取目的基因,反转录,-,聚合酶链反应法,(,一,),从人体细胞内提取胰岛素基因转录的,mRNA,1,细胞总,RNA,的提取,:,取胰岛,B,细胞，用,PBS,洗后，加入,TRIZOL,试将细胞破裂，后用,DEPC,处理，多次离心后，取,RNA,白色沉淀，测,OD,值，电泳。,2,，从总,RNA,中分离,mRNA,：,取上述提取的总,RNA,若干，加入,Buffer OBB,，,Oligotex Suspension,，打匀。,70,水浴（裂解,RNA,的二级结构），,20-30,条件下，静置（让,Oligotex,与,mRNA,结合）。,将,Oligotex/mRNA,复合物的沉淀加到,EP,管,SPIN,柱上高速离心，加,Buffer,将其他,RNA,洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化,mRNA,。,一，获取目的基因反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取,（二）,mRNA,转录合成,cDNA,第一链,cDNA,第一链的合成,加入上步获得的,mRNA,和适当引物于,EP,管中，加入,RNase-free water,，混匀后,70,反应,10,分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上,5min;,稍微离心一下,顺序加入缓冲液、,RNA,酶抑制剂、反转录酶、,dNTP,（加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42,放置,2,分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。,（三）,PCR,法扩增，特异合成目的,cDNA,链,通过胰岛素的特异引物，用,PCR,法进行扩增，特异的合成胰岛素的,cDNA,链,获得目的基因（通过凝胶电泳回收测序后方可使用）。,（二）mRNA转录合成cDNA第一链cDNA 第一链的合成（,前端引物：,5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3,后端引物：,5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3,PCR,法的操作步骤：,预变性,引物退火,引物延伸,循环,25-35,次,最后延伸,前端引物：PCR法的操作步骤：,6,二，组建重组质粒,采用,pBR322,作为载体，用双酶切法进行基因重组。,一、,pBR322,简介,F.Bolivar,和,R.L.Rodriguez,人工构建载体。,其作为载体的优点为：,双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,中都死亡。获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,其中之一中死亡。,外源基因,BamH I,Amp,中存活,但在,Tet,中死亡,外源基因,Pst I,Tet,中存活,但在,Amp,中死亡,二，组建重组质粒采用pBR322作为载体，用双酶切法进行基因,分子小，克隆能力大,载体越小越好。,10kb,的,DNA,在纯化过程中容易断裂。,高拷贝数,氯霉素扩增之后，每个细胞可达,10003000copy,安全,失去了转移蛋白基因,mob,（,mobilization),不能通过接合转移。,.,双酶切法,用两种酶限制性内切核酸酸消化载体,DNA,和外源,DNA,片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组,DNA,分子，从而实现,DNA,的定向连接。,.,重组过程,pBR322,用,Hind,和,BamH,酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源,DNA,片段同样也用,Hind,和,BamH,酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源,DNA,片段混合退火，因为,Hind,和,BamH,的黏性末端不匹配，避免了载体和外源,DNA,片段的自身连接，外源,DNA,片段只能定向地连接到载体的,Hind,和,BamH,位点之间。当然也不可避免发生载体的,Hind,和,BamH,的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。,分子小，克隆能力大,8,三，构建基因工程菌,A,链和,B,链同时表达法,(,一,),重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,三，构建基因工程菌A链和B链同时表达法(一)重组人胰岛素的大,9,重组,DNA,的转化,1,CaCl,2,法制备大肠杆菌感受态细胞：,取100,ml,菌体培养至,OD600=0.5，,离心收集菌体，用10,ml,冰冷的10,mM,CaCl2,溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1,ml,冰冷的75,mM,CaCl2,溶液悬浮菌体，冰浴放置12-24小时，备用。,2,，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100,ml,感受态细胞，加入相当于50,ng,载体的重组，,DNA,连接液，混匀。冰浴放置半小时。在42 保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1,2,分钟。加入1,ml,新鲜培养基，于37 培养 1 小时（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。,重组DNA的转化1,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：,经典的,CaCl,2,转化方法,经典的CaCl2转化方法,11,(,二,),重组子的筛选和鉴定（,载体遗传标记检测）,基本操作：,先将转化液涂布含有,Ap,的平板，再将,Ap,平板上的转化子影印至含有,Ap,和,Tc,的平板上，在,Ap,平板上生长，但在,Ap,和,Tc,平板上不长的转化子即为重组子。,抗药性筛选法：,抗药性筛选法的基本原理,：,将外源,DNA,片段插在,EcoRI,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,将外源,DNA,片段插在,BamHI,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,s,再经,l,琼脂糖凝胶电泳，限制性图普，,PCR,检测,DNA,测序以及,SDS-PAGE,等分析，检测并证实了整个重组体的构建和表达筛选过程,(二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）基本操作：抗药性,12,四，培养工程菌,采用比浊法测定不同时间培养基中菌量，,绘制基因工程菌的生长曲线，,在摇瓶培,养的水平下,，,采用优化的发酵培养基发酵基因,工菌，培养,4,小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延长至,17,小时。,1,，正交优化实验：,采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速,(,通风量,),，,IPTG,诱导温度，接种量，,IPTG,添加量，诱导时间，补料方式。分别用,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,表示以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的,A,600,为目标量，考察条件优化的效果，进行八次实验，对实验结果进行分析，优化出最佳实验条件。,2,，其他条件优化：,在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重,组蛋白诱导的影响作了分析。,3,，放大培养（比较不同发酵工艺产量）：,在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至,1 L,培养基中比较两种,发酵工艺。在不同转速，通气量，,pH,条件下，比较选择产量最高的发酵工艺。,优化发酵条件,四，培养工程菌采用比浊法测定不同时间培养基中菌量，优化发酵条,五，产物分离纯化,由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。,基因工程药物的分离纯化一般不应超过,4-5,个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。,五，产物分离纯化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细,发酵液,细胞分离,胞内产物,细胞破碎,固液分离,包含体,细胞碎片分离,变 性,复 性,透析浓缩,再复性及酶转化,高度纯化,制 剂,高速离心,溶菌酶超声破碎细胞,变性剂,&,离子型去污剂,洗涤,二次复性法,复性,变性剂（尿素）,变性,胞外产物,发酵液细胞分离胞内产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变,二次复性法,：,0,5g,包涵体溶解于一定量的缓冲液,B(50mmol,L,GlyNaOH,，,8 mol,L,尿素，,B_,巯基乙醇，,pH 9,5),中，使之充分混悬，,静置,1,小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液,C(50mmol,LGly-NaOH,，,半胱氨酸一胱氨酸，,pH 9,5),中，,4,静置复性过夜。上样于已用,50mmol,L,GlyNaOH(pH 9,5),平衡的,DEAE-Sepharose FF,柱，用,0,1mol,L,的氯化钠梯度洗脱，通过,SDS-PAGE,确定,RRhPI,位置，用,DEAE-Sepharose FF,做离子交换层析，,收集含,RRhPI,的洗脱峰,2,，层析图谱见（图,6,）。电泳检测显示,(,图,11),峰,2,主要为,RRhPI,，及少量高分子杂质，,收集峰,2,做再复性。峰,1,为,pH,高于,9,5,及一些疏水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分,pH,低于,RRhPI,的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及,2mol,L NaCl,的条件下被洗脱下来，形成其他峰,3,和峰,4,。,二次复性法：05g包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmo,16,胰岛素原（,RRhPI,）的再复性及酶切转化：,1,复性,将初步复性及纯化后的,RRhPI,通过透析浓缩，先后转换到缓冲液,B,和,D(50mmol,L G1y-NaOH,，氧化型谷胱甘肽,(GSSG),一还原型谷胱甘,(GSH)pH9,5),中，使蛋白浓度为,0,1,O,6 mg,ml,，,4,静置过夜。,2,酶切,复性后的,RRhPI,复性液调节,pH,后加入一定量的胰蛋白酶,(trypsin),和羧肽酶,B(carboxypeptidase B),在,37,。,C,进行协同酶切一段时间，然,后滴加,2 mol,L ZnCI,：至,ZnCl,：浓度为,0,1mol,L,终止反应并沉淀生成的,hI,，用双蒸水洗涤沉淀得较纯,B9,重组人胰岛素约,79 mg/L,培养基。,重组胰岛素粗品的纯化：,胰岛素粗品用,0,2 mol,L NaAcHAc,，,pH4,0,溶解。溶解后的样品通过,Superdex 75,进行纯化,(,图,10),，得,1,、,2,、,3,峰，收集峰,3,，透析后冻干即,为胰岛素产品所得胰岛素产品用,SDS-PAGE,分析为单带，电泳检测见图,11,。,胰岛素原（RRhPI）的再复性及酶切转化：重组胰岛素粗品的纯,17,六，除菌过滤,传统过滤只能滤去空气中的尘埃、液体中的异物微粒，很难去除微生物活体（细菌、病毒及热原体）；薄膜过滤是微孔筛分，大于孔径的微粒均被截留，微生物粒子大小为,0.5-2,微米，只要选用,0.45,微米 的微孔滤膜即可将微生物截留去除，用,0.22,微米的微孔滤膜则可能将病毒、热原体去除。,注射用药液除用传统过滤器去除药液中的异物外，现已采用微孔滤膜将澄清的药液再次除菌、除热原，其滤膜孔径最好在,0.22,微米以下。制药空气的过滤亦因,GMP,的不同级别要求而采用相应的器材、过滤器。要指出的是，制药无菌空气的供应仅采用传统滤材、滤器往往不能达到要求，其终端必须选用微孔薄膜，孔径必须在,0,。,45,微米以下。,注射用无菌药液的处理,：按,GMP,要求，注射用药液应当无菌无热原，本品药液配制好后，经过粗砂棒、细砂棒（,适当使用滑石粉或