,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,水微生物检测,南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心,水微生物检测南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心,1,教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生,实验课时：8学时,课程类型：专业实验课,课程要求：必修,每组人数：2人,教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生,2,实验目的与要求,掌握水样采集规则及注意事项。,熟悉常用水卫生细菌学指标。,熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。,学会对所检测的水样作综合分析。,实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。,3,水微生物检测的意义,水体的微生物污染,问题日趋严重。,在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，,适于各种微生物的生长,。,水体中,微生物污染的来源,：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。,水体中,少数致病微生物,（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。,水微生物检测可用于,评价水质情况，预报水质的污染趋势，,以保证水质的卫生安全。,水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。,4,在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是,无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测,。,一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过,对指示菌的检测,，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。,在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种,5,水微生物的检测指标,菌落总数,(aerobic bacterial count),是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。,检测意义：作为,一般性污染的指标,，即,评价被检样品的微生物污染程度和安全性,。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但,不能说明污染的来源,。,水微生物的检测指标菌落总数(aerobic bacteria,6,水质微生物的检测指标,总大肠菌群,(coliform bacteria),是指一群需氧及兼性厌氧的，37生长时能使,乳糖发酵,，在24h内产酸产气的,革兰氏阴性无芽胞杆菌,。,检测意义：作为,粪便污染的指标,。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。,水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliform bacte,7,实验内容,水样采集；,菌落总数的测定；,总大肠菌群的测定。,实验内容水样采集；,8,一、水样采集,一、水样采集,9,采样原则,所采集的样品具有,代表性,。,采样容器：选择硼硅,玻璃瓶,和聚乙烯塑料瓶。,不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。,必须按一般,无菌操作,的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。,采样原则,10,自来水水样,：,先将自来水龙头用火焰,烧灼3min灭菌,，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水1,3min）后，采集水样于,无菌锥形瓶,，约,占瓶容量80%,，以便摇匀水样。,水源水水样,：,选有,代表性的地点,及可疑地方，一般,距水面下10,15cm采样,。采样后，将,瓶塞盖好，再从水中取出,。,自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙,11,注意事项,严格无菌操作,。,做好标记,：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。,从速送检,。水样从采集到检验不应超过2h，在04下保存不应超过24h。,注意事项,12,二、菌落总数的测定,平板菌落计数法,二、菌落总数的测定 平板菌落计数法,13,（一）生活饮用水,器材与试剂,无菌1ml吸管1支/组，无菌平皿3个/组，营养琼脂。,（一）生活饮用水器材与试剂,14,方法,水样摇匀,2025次，使细菌分散。,倾注培养,：无菌吸取1ml水样分别置于,2个空平皿,，另一个作,空白对照,。再倾注15ml琼脂（约45）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后,倒置,3724h。,菌落计数,：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。,方法,15,结果分析与报告,计算,平均菌落数,：,报告方式：菌落总数(,cfu/ml,)。,cfu：colony forming units,当检样的菌落数为l100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。,国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。,结果分析与报告,16,（二）水源水,器材与试剂,无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。,无菌平皿9个/组，营养琼脂。,90ml灭菌,盐水1瓶,（内置适量玻璃珠），9ml灭菌,盐水管3支,。,（二）水源水器材与试剂,17,方法,稀释水样,：,无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。,取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000,1:10000水样。,方法,18,方法,倾注培养,：,用1ml无菌吸管吸取,23个适当浓度的稀释液,1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。,菌落计数,：方法同饮用水。,方法,19,菌落总数测定,菌落总数测定,20,结果分析与报告,计算,不同稀释度,的平均菌落数：,稀释度的选择,和菌落总数报告方式：,首先选择平均菌落在30,300之间者进行计算。,计算方法和报告方式如表1所示。,结果分析与报告,21,表1稀释度选择及菌落总数报告方式,例,次,不同稀释度的平均菌落数,两稀释,度菌落,总数之比,菌落总数,(,cfu,m1),报告方式,(,cfu,m1),10,-1,10,-2,10,-3,1,2,3,4,5,6,7,8,1365,2760,2890,150,多不可计,27,多不可计,0,164,295,271,30,4650,1l,305,0,20,46,60,8,513,5,12,0,1.6,2.2,2,16400,37750,27100,1 500,513000,270,30500,110,16000或1.610,4,38000或3.810,4,27000或2.710,4,1500或1.510,3,510000或5.110,5,270或2.710,2,31000或3.110,4,10,表1稀释度选择及菌落总数报告方式例不同稀释度的平均菌落数两,22,由表2可判定水质被污染的程度。,表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系,水的类别,最清洁水,清洁水,不太清洁水,不清洁水,极不清洁水,菌落总数,cfu,m1,10100,100,1000,1000,10000,10000,100000,100000,由表2可判定水质被污染的程度。水的类别最清洁水清洁水不太清洁,23,注意事项,菌落总数测定中，应,选择合适的稀释度,进行,。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养）,各稀释管、相应平皿,做好标记,。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。,严格无菌操作,。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。,倾注时，要,注意营养琼脂的温度,。,倾入琼脂后要,混匀,，待琼脂凝固后,倒置,培养。,注意事项,24,三、总大肠菌群的测定多管发酵法,分为三步：,初发酵试验,平板分离,复发酵证实试验,三、总大肠菌群的测定多管发酵法分为三步：,25,初发酵试验,：,采用乳糖蛋白胨培养液37培养24h，观察,产酸产气,情况。,平板分离,：,对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察,菌落特征,，并进行,革兰氏染色,和镜检。,复发酵证实试验,：,对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵,证实试验,，并根据标准所附检数表报告结果。,初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37培养24h，观察产酸产,26,产气,初发酵、复发酵试验结果,产气初发酵、复发酵试验结果,27,大肠菌群EMB上菌落特征,大肠菌群EMB上菌落特征,28,大肠菌群革兰染色形态,大肠菌群革兰染色形态,29,（一）生活饮用水,器材与试剂,2瓶50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（,内有导管,）,10支5ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（,内有导管,）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。,EMB，革兰染液等。,（一）生活饮用水器材与试剂,30,方法,初步发酵试验,：,接种水样总量为300ml（100ml 2份，10ml 10 份，,12支发酵管,）,。37培养24h。,平板分离,：,将产酸产气及只产酸不产气(,发酵乳糖,)管接种EMB,37培养24h，取典型菌落作革兰氏染色镜检。,复发酵试验,：,革兰氏染色镜检为,革兰阴性无芽胞杆菌,，取该菌接种于普通浓度乳糖蛋白胨(每管接13个菌落),37培养24h，有,产酸产气,者即证明有大肠杆菌的存在。,方法,31,产酸产气,报告为大肠菌群阳性,产酸产气报告为大肠菌群阳性,32,结果分析与报告,根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查,接种水样总量为300ml检数表,（表3）。,报告,每升水样中的大肠菌群数,（MPN 值，Most Probable Number，最大可能数法）。,国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水大肠菌数每升不得超过3个。,结果分析与报告,33,表3 大肠菌群数检数表,接种水样总量300ml（100ml 2份，10ml 10 份）,10,ml,水,量的阳,性管数,100,ml,水量的阳性管数,0,1,2,每升水样中大肠菌群数,每升水样中大肠菌群数,每升水样中大肠菌群数,0,l,2,3,4,5,6,7,8,9,10,3,3,7,11,14,18,22,27,31,36,40,4,8,13,18,24,30,36,43,51,60,69,11,18,27,38,52,70,92,120,161,230,230,表3 大肠菌群数检数表接种水样总量300ml（100ml,34,（二）水源水,器材与试剂,1ml吸管3支/组，10ml吸管1支/组，10ml普通发酵管（内有导管）3支/组，5ml三倍发酵管（内有导管）1支/组。,EMB，革兰染液等。,（二）水源水器材与试剂,35,方法,稀释水样,：,水样做1:10及1:100稀释。方法同菌落总数测定。,初发酵试验,：,接种水样总量11.11ml，,4支发酵管。取10ml原水样注入5ml三倍乳糖发酵管（内有导管）；取1ml原水样、1ml 1:10及1:100稀释水样分别注入10ml普通乳糖发酵管（内有导管），37培养24h。,平板分离与复发酵试验,：,同生活饮用水。,方法,36,结果分析与报告,根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查,接种水样总量为11.11ml检数表,（表4），报告每升水样中的大肠菌群数。,结果分析与报告,37,表4 大肠菌群数检数表,接种水样总量11.11ml（10ml、1ml、0.1ml、0.01ml 各1份）,接种水样总量(,ml),每升水样中大肠菌群数,10 1,0.1 0.01,地,表4 大肠菌群数检数表接种水样总量11.11ml（10ml,38,注意事项,总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因些,采用不同的接种量，检数表也不相同,。,当,接种量超过1毫升,时，一般,采用多倍浓度培养液,。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。,做好标记,。,严格无菌操作,。每一稀释度均需更换吸管。,注意事项,39,实验安排,当日：水样采集、,倾注培养,、初发酵试验。,第二日：,菌落计数及结果报告,、平板分离。,第三日：涂片，革兰氏染色，镜检、复发酵试验。,第四日：报告大肠菌群数。实验报告，并对所检测的水样进行综合分析。,实验安排当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。,40,