单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第,六,章高效液相色谱分析法,一、,高效液相色谱法的特点及基本原理,Characteristic and basic principle of LC,二,、液相色谱的固定相与流动相,stationary phase and mobile phase of HPLC,三、,分离类型选择,choice of separating types,第一节主要分离类型与原理,high performance liquid chromatograph,basic principle and main separating types,2024/11/15,第六章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的特点及基本原理,1,概 述,以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法,(HPLC),，是,20,世纪,60,年代末发展起来的一项新颖快速的分离分析色谱技术。它是在经典的液体柱色谱法的基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱,柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。,HPLC,几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。,2024/11/15,概 述 以高压液体为流动相的液相色谱分析,2,一、高效液相色谱法的特点及基本原理,Characteristic and basic principle of LC,（一）特点：,高选择性能同时分离性质极为相似的混合物,高效能在较短的时间内能同时分离极为复杂的混合物，一般一次色谱分析时间为几分钟到几十分钟，有些快速分析一秒钟可分析,7,个组分。,高灵敏度使用高灵敏度检测器可检测,10,-11,10,-13,g,的物质，色谱不仅可以作常量分析，也可以作微量和痕量分析。,高压,高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。,2024/11/15,一、高效液相色谱法的特点及基本原理Characterist,3,液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物，而且比气相色谱流动相的选择余地大。由于,HPLC,的具有色谱柱可以反复使用，流动相可选择范围宽，流出组分容易收集，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广,(,样品不需气化，只需制成溶液即可,),，定量分析方法的准确度高的特点，在,中国药典,中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。不足之处是定性能力较差。,2024/11/15,液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后,4,液相色谱几个名称,高速液相色谱(,High Speed Liquid Chromatography),高效率液相色谱(,High Efficiency Liquid Chromatography),高压液相色谱(,High Pressure Liquid Chromatography),高效(能)液相色谱(,High Performance Liquid Chromatography),2024/11/15,液相色谱几个名称高速液相色谱(High Speed Li,5,GC,：,在不衍生情况下，,GC,分析样品的分子量,500,；,GC,的样品必须是挥发性的；,GC,的样品必须具有良好的热稳定性。,LC,：,从理论上讲，,LC,分析样品的分子量没有限制；,LC,的样品必须可溶解；,由于,LC,的分析温度可以从低于室温到,100,140,，所以对样品热稳定性没有要求。,（二）,GC,与,LC,的区别,2024/11/15,GC：在不衍生情况下，GC分析样品的分子量,甲酰胺,乙腈,甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,二氧六环,四氢呋喃,甲乙酮,正丁醇,乙酸乙酯,乙醚,异丙醚,二氯甲烷,氯仿,溴乙烷,苯,四氯化碳,二硫化碳,环己烷,己烷,煤油,(,最小,),2024/11/15,3.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。,25,4.,选择流动相时应注意的几个问题,（,1,）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（,2,）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（,3,）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（,4,）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2024/11/15,4.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂,26,三、,分离类型选择,choice of separating types,2024/11/15,三、分离类型选择choice of separating,27,四、影响分离的因素,1.,影响分离的因素与提高柱效的途径,在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项,B/U,较小，可以忽略不计，即：,H=A+C u,故液相色谱,H-u,曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，,故降低传质阻力是提高柱效主要途径。,由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过,增加柱温来改善传质。恒温,改变淋洗液组成、极性是,改善分离的最直接的因素。,2024/11/15,四、影响分离的因素1.影响分离的因素与提高柱效的途径,28,2.,流速,流速大于,0.5 cm/s,时,H,u,曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.,固定相及分离柱,气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,2024/11/15,2.流速 流速大于0.5 cm/s时,29,4.,液相制备色谱,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。,半制备柱（内径,8mm,，长度,15,30cm,），一次制备量,.1,mg,；,色谱柱的柱容量（柱负荷）,对分析柱：,不影响柱效时的最大进样量；,对制备柱：,不影响收集物纯度时的最大进样量；,超载：,进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。,超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子,k,降低,10%,为宜。,2024/11/15,4.液相制备色谱 获得高纯物质（色谱纯）的有效方,30,液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况：,（,1,）可获得良好分离，主峰,使用制备柱，超载提高效率；,（,2,）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,2024/11/15,液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：2023/8/,31,应用实例：环境中有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅胶,(37,50,m),流动相：正己烷,流 速：,1.5 mL/min,色谱柱：,50cm,2.5mm(,内径,),检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2024/11/15,应用实例：环境中有机氯农药残留量分析 可对水果,32,稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相,流动相：,20%,甲醇,-,水,100%,甲醇,线性梯度淋洗，,2%/min,流 速：,1mL/min,柱 温：,50,C,柱 压：,70,10,4,Pa,检测器：紫外检测器,2024/11/15,稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八,33,