,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章吸附层析,第一节概述,一、基本概念和色谱过程,1,、概念,色谱法,(Chromatography），,也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。,色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。,2,、色谱过程,3,、色谱方法的共同特点：,色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。,色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对 运动。,被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。,4,、样品在分离时的两个基本点：,混合物中不同组分在柱内的差速迁移,同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散,二、色谱法分类,1,、按两相物理状态分类：,用气体作流动相,气相色谱,用液体作流动相,液相色谱,固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要色谱类型：,气固色谱（,gas-solid chromatography,GSC）,气液色谱,（,gas-liquid chromatography,GLC）,液固色谱,（,liquid-,solid chromatography,LSC),液液色谱,（,liquid-,liquid chromatography,LLC,2,、按固定相的形态分类,（,1,）柱层析(,column chromatography),固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。,（,2,）平板层析(,planar chromatography),固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析,(TLC),；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析,(PC),。,3,、按分离过程物理化学原理分类,（,1,）吸附层析(,absorption chromatography,),用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。,（,2,）分配层析(,partition chromatography),用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析，液液分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为正相层析和反相层析。,正相分配层析（,NPC),一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。,反相分配层析（,RPC),以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。,（,3,）离子交换层析,ion-exchange chromatography,（,4,）凝胶层析,gel chromatography,（,5,）亲和层析,affinity chromatography,三、层析法的优点,生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混合物、复合物）存在，对环境如温度、,pH,条件、离子强度的要求较高。,用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。,层析法的优点,1,、在室温下操作,2,、流动相的,pH,值可以与生理液相似选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂,3,、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离提供了温和的条件和,“,软接触,”,，利于保持其原有的构象和生理活性。,4,、样品量可多可少，可用于制备和分析。,第二节 吸附柱层析,一、常用术语,1.固定相：,层析基质,2.流动相：,洗脱剂、展层剂,3.层析：,样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终使各组分得到分离。,4.操作容量：,在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的,mmol,数或,mg,数表示。,固定相,流动相,5.床体积：,膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积（,Vt,）。,6.洗脱体积：,某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。,7.膨胀度：,单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（,V,）。,8.分配系数和迁移率,K,在固定相中的含量,在流动相中的含量,R,f,在固定相中移动的距离,在流动相中移动的距离,外水体积,Vo,洗脱体积,Ve,固定相,层析床,床体积外水体积,基质体积内水体积,Vt Vo Vg Vi,二、基本原理,生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合,在洗脱剂（流动相）的作用下，通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。,影响吸附层析分离效果的因素,吸附剂的性质,洗脱剂的性质,层析柱及装填技术,对样品的要求,加样方式及加样量,柱效,三、吸附剂的选择,选择性好,对不同物质的吸附力差异性大,表面积大,增加吸附容量,性质稳定,不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破碎。,颗粒均匀、表面积大,成本低廉,1,、选择原则,2,、,常用吸附剂的特点,羟基磷灰石：性质稳定、吸附容量大、适用范围广,硅胶：化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含水量关系密切（含水量高，活性小）,极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。,四、溶剂与洗脱剂,溶剂：溶解样品的溶液,洗脱液：洗脱吸附柱的溶液,选择时，从样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸附柱中洗出。,1,、概念,2,、选择洗脱剂的原则,性质稳定：,不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩,纯度高：,防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形成的污染,能较完全洗脱下所分离的成分,低粘度：,高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降低效率,样品容易回收,无吸收背景：,提高检测的灵敏度,五、层析柱及装填技术,1,、层析柱,吸附层析柱一般,d:h 1:10,1:40,2,、吸附剂用量,为分离样品的 30 50 倍,3,、柱子的装填,干装与湿装,六、层析样品的要求,样品的溶解度好,加入的样品量利于提高分辨率,加样量,Vt,Vt。,样品的浓度与粘度的考虑,2,10,1,1,注意：加样时避免冲动基质,七、洗脱,1,、原理,溶解（解吸附），吸附，再溶解，再吸附，被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动，又吸附到新的吸附剂上，再被洗脱剂解吸，如此反复，各组分吸附能力及溶解能力的差别导致移动距离的差异，使各种成份形成各自的区带，样品得以分离及纯化。若分离物是有色的，便看见色谱层。,2,、流速与分离效果,流速太慢，前峰拖尾与后峰相连,流速太快，组分分不开,正常的流速使组分完全分离,装填层析柱,柱的平衡,加样,洗脱,收集,测定,绘制洗脱曲线,合并有效成份,计算含量（酶活力）,基质的再生,八、操作程序,第二节薄层层析,一、原理：,将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。,二、优点：,1,、展层时间短,2,、设备简单、操作方便,3,、干扰因素小,4,、显色方便,5,、灵敏度高,三、操作及注意事项,1,、吸附剂的选择,硅胶：,略带酸性，适合于酸性和中性物质的分离。,氧化铝：,微碱性，适合于碱性和中性物质的分离。,2,、薄层板的制备,（,1,）薄层的厚度与,R,f,值,薄层厚度,200,M,，,R,f,基本不变,（,2,）薄层的活化,100,o,C,1h,硅胶薄层薄板的活性测定,苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为,A B C D,（,3,）,薄层的活性测定,3,、样品的要求,（,1,）样品的浓度,1-5mg/ml,（,2,）样品的纯度不含盐,（,3,）样品与吸附剂的作用,（,4,）样品的溶剂使用挥发性有机溶剂,4,、展层剂的选择,（,1,）种类,单一溶剂、混合溶剂,（,2,）要求,使样品组分很好地溶解,与样品不发生化学反应,将混合样品较好分离,易挥发、粘度小、组成简单,临时新配，只使用一次,展层剂的极性,在同一支持介质上，溶剂极性愈大，对同一化合物的洗脱能力也愈大，即在薄板上被推进得愈远，,R,f,值愈大。,不同展层剂对物质的分离影响,咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果,特异性显色剂,紫外光、荧光显色,薄板中含荧光素,腐蚀性显色剂,6,、显色,5,、,展层装置与展层过程,（,1,）使用适当的装置,（,2,）装置的饱和度对展层的影响,6,、操作程序,1,、制备薄层板,2,、点样：点样斑点小，点样量适当,3,、展层,4,、显色,第三节 聚酰胺薄膜层析,一、基本原理,聚酰胺是由己二酸与己二胺合成的、含有大量酰胺基团的化学聚合体。它与许多物质通过形成氢键的方式结合，氢键的强弱决定被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附力的大小。选择适当的展层剂使被分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，导致被分离物分离。,二、应用,1,、蛋白质,N,末端的,DNS,分析技术,DNS-,蛋白质,DNS-,肽,荧光试剂（,DNS-CL）,+,蛋白质（肽,）,酸解,pH2-2.5,抽提,DNS-N,末端氨基酸,层 析,显 色,分析,丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物，也常用于多肽链的,N,末端氨基酸的鉴定。,2,、蛋白质的氨基酸组成分析程序,蛋白质在盐酸中水解110，1824小时,中和,DNS-Cl,调,pH9-10.5,盐酸调,PH 23，,乙酸乙酯抽提,DNS-,氨基酸层析,