,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养,细胞培养,为什么要进行细胞培养?,1)直接了解不同物质对细胞产生的影响,排除未知因素的干扰。（克隆羊）,2）,外加物质对细胞作用的速度快，停止也快。,3）理论上生产效率高。,为什么要进行细胞培养?1)直接了解不同物质对细胞产生的影响,单细胞的分离,（如何分离？）,一.由植物器官分离单细胞,1.机械法,特点：细胞不受酶的伤害作用；,无须质壁分离,2.酶解法,特点：在某些情况下，可以得到比较纯的目的细胞。,单细胞的分离（如何分离？）一.由植物器官分离单细胞,二.由培养组织中分离单细胞,（除了前述方法，如何利用组培技术进行单细胞分离？）,把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，这个过程称作继代。,通过继代：增殖愈伤组织、提高其松散性。,震荡的作用：破碎；匀化；换气。,二.由培养组织中分离单细胞（除了前述方法，如何利用组培技术,悬浮培养,一.一般技术,1.分批培养,分批培养：是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。,为使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代。,悬浮培养一.一般技术,滞后期的长短主要取决于继代时原种培养细胞所处的生长期和转入的细胞数量。,如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。,（如何降低细胞培养的难度？）,条件培养基：在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基。,它可以缩短滞后期的长度。,滞后期的长短主要取决于继代时原种培养细胞所处的生长期和转入的,*为了获得充分分散的愈伤组织，最重要的是一开始就尽可能使用易散碎的愈伤组织。,*分批培养不是一种理想的培养方式。,*为了获得充分分散的愈伤组织，最重要的是一开始就尽可能使用,2.连续培养,连续培养：是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，在培养物的容积保持恒定的情况下，培养液中的营养物质能够不断得到补充。,缺点：设备复杂；耗费人力,2.连续培养连续培养：是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养,3.由悬浮细胞再生植株,悬浮细胞 体细胞胚,悬浮细胞 愈伤组织 体细胞胚,对于单细胞、低密度悬浮细胞、或过于细小的细胞团，则应待形成较大的细胞团后，在转到半固体培养基上诱导愈伤组织。,3.由悬浮细胞再生植株悬浮细胞,二.细胞悬浮培养的培养基,1.条件培养基,在初始细胞浓度过低的悬浮培养中使用。,看护培养物的代谢产物促进了细胞生长的活性。,二.细胞悬浮培养的培养基1.条件培养基,2.培养基的震荡,转速、冲程都要适中,三.悬浮培养细胞的同步化,同步培养：是指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。,（为什么要同步？如何同步？）,2.培养基的震荡转速、冲程都要适中,1.饥饿法,2.抑制法,四.悬浮培养中细胞生长的计量,1.细胞计数,分离细胞团 计数,2.细胞密实体积（,PCV）,用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。,手段,离心,1.饥饿法,本质是对新陈代谢能力的测定,方法：,相差显微术法,(,胞质环流和核的存在,),；,四唑盐还原法（氯化三苯基四唑即,TTC,还原成红色染料）；,荧光素双醋酸酯法（,活细胞内,FDA,被脂酶裂解，将能发荧光的荧光素释放出来，且荧光素不能自由穿越质膜所以就在完整的活细胞的,细胞质,中累计起来。死细胞核破损细胞中则不能积累。,）；,伊凡蓝法（只有活力已受损的细胞能够摄取该燃料，完整的活细胞则不能。）。,3.细胞鲜重,滤去细胞沾着的多余水分再称重。,4.细胞干重,60下干燥12,h,再称重,五.培养细胞活力的测定,（以你们理解，何为细胞活力，可如何测定？）,本质是对新陈代谢能力的测定3.细胞鲜重,单细胞培养,（相对普通外植体培养，单细胞培养难易如何？为什么？应如何进行？）,一.培养方法,1.平板培养法,镜检次数越少越好。,注意不同物种有最适植板密度，也有临界密度。,2.看护培养法,特点：把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔。,该愈伤组织提供：营养；促进分裂的其它物质,单细胞培养（相对普通外植体培养，单细胞培养难易如何？为什么,3.微室培养法,用条件培养基代替了看护组织。,二.影响单细胞培养的因子,培养基的成分；初始植板细胞密度,对于细胞分裂有关的因素缺乏精确的了解。,3.微室培养法,细胞培养的应用,一.突变体选择,细胞比完整植株更容易变异。,二.天然化合物的生产和生物转化,1.细胞大量培养,高产细胞系建立,“,种子,”,培养,大量培养,生产上的两步法：先扩增生物量；再促进次生代谢产物的合成。,细胞培养的应用一.突变体选择,2.天然化合物的生产,大多产量有限，不稳定。,3.生物转化,4.细胞固定化,目的：使细胞所处的理化环境与整体植株中所处的环境接近，从而发挥正常的代谢功能。,通过培养基的循环供应：保证营养；避免反馈抑制。,平床培养系统；柱形培养系统,5.诱导多倍性,2.天然化合物的生产,作业：,1,复习讲授内容，熟悉各种细胞培养方法。,作业：,